Mecanismos de splicing alternativo do fator de transcrição MEF2C : implicação na patogênese da insuficiência cardíaca

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vaggione, Maria Luísa Boldim, 1994-
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637962
Resumo: Orientador: Kleber Gomes Franchini
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spelling Mecanismos de splicing alternativo do fator de transcrição MEF2C : implicação na patogênese da insuficiência cardíacaMEF2C transcription factor alternative splicing mechanisms : implication in the pathogenesis of heart failureFatores de transcrição MEF2Insuficiência cardíacaProcessamento alternativoRbFoxProteínas CELFMEF2CHeart failureAlternative splicingRBFOXCELFOrientador: Kleber Gomes FranchiniDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Os fatores de transcrição da família MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) são proteínas que se ligam em sequências de DNA ricas em A/T, constitutivas de regiões regulatórias de múltiplos genes, destacadamente genes que codificam proteínas sarcoméricas e enzimas que controlam o metabolismo energético do coração. Dados clínicos e experimentais indicam que a desregulação do fator MEF2C correlaciona-se com o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, porém, os mecanismos subjacentes permanecem pouco conhecidos. O fator MEF2C diferencia-se dos demais membros da família devido à presença de um fragmento, alternativamente regulado, denominado `?¿ (gama), presente no último exon, que confere função repressora às suas variantes. No presente estudo, investigamos a regulação de transcritos de Mef2c em camundongos submetidos à infarto do miocárdio e o transcritoma de camundongos transgênicos que superexpressam MEF2C?+ e MEF2C?- exclusivamente em cardiomiócitos (TgMEF2C?+ e TgMEF2C?-). Além disso, exploramos os fatores potencialmente envolvidos na inclusão do fragmento ? durante o processo de splicing alternativo. Em camundongos infartados foi observado aumento em transcritos de Mef2c?+, acompanhado pelo aumento na expressão de genes marcadores de proliferação celular e diminuição de transcritos de genes estruturais e relacionados ao metabolismo energético. Camundongos TgMEF2C?+ desenvolveram insuficiência cardíaca de forma espontânea associado ao mesmo padrão de alteração gênica observado nos animais infartados, em transcritos de genes relacionados ao ciclo celular, estrutura e metabolismo. Devido às alterações observadas na expressão de genes associados à proliferação celular, quantificamos os transcritos Mef2c?+ e Mef2c?- em mioblastos cardíacos H9c2 durante o processo de diferenciação celular in vitro. Observamos que os transcritos de Mef2c?+ diminuem significativamente durante a diferenciação celular, concomitante ao aumento na expressão da isoforma ?-. Com base na relevância da região gama, investigamos os potenciais reguladores da inclusão de gama durante o processamento alternativo de Mef2c por meio de avaliação in silico das sequências de nucleotídeos que flanqueiam esse domínio. Identificamos fatores potencialmente envolvidos na regulação do splicing alternativo dessa região, sendo eles: RBFOX1, RBFOX2, CELF1, CELF2. Utilizando ensaios com minigene que promove a transcrição da região sujeita ao splicing em células de mamífero, observamos que o fator de splicing RBFOX1 foi capaz de alterar de forma significativa a quantificação relativa dos transcritos de Mef2c?+ e Mef2c?-, propiciando um aumento na inclusão do domínio gama. Mutações sítio-dirigidas nos motivos de reconhecimento de RBFOX1 próximos à região gama não foram capazes de alterar esse resultado. O fator RBFOX2 promove tendência de diminuição na inclusão da região gama e aumento significativo em transcritos de Mef2c??. O fator de splicing CELF2 aparenta não ter efeito sobre o splicing alternativo da região gama. Em conjunto, os resultados obtidos neste projeto fortalecem a hipótese de que a inclusão de ? em MEF2C está associada aos efeitos deletérios observados em cardiomiócitos durante o desenvolvimento da insuficiência cardíaca e indicam potenciais protagonistas da regulação do splicing alternativo desse domínio transrepressorAbstract: MEF2 transcription factors (Myocyte Enhancer Factor 2) were first described as proteins that bind to DNA sequences enriched in A/T sequences located at the regulatory region of multiple genes, including genes that encode sarcomeric proteins and enzymes related to heart metabolism. Abnormal expression of MEF2C is related to the development of heart failure, although the mechanisms underpinning it are not fully understood. Unlike the other members of the family, MEF2C presents an alternative splice acceptor in the last exon, giving rise to a domain designated as `?¿ (gamma), which can be included or skipped during the processing of the precursor mRNA. Its inclusion is related to transrepression function of the transcription factor MEF2C. In the present study we investigated the regulation of Mef2c transcripts in mouse model of myocardial infarction and the transcriptome of transgenic mice that overexpress MEF2C?+ and MEF2C?- exclusively in cardiomyocytes (TgMEF2C?+ and TgMEF2C?-). We also explored the splicing factors presumably involved in the inclusion of the ? domain during alternative splicing. In infarcted mouse we observed increased levels of Mef2c?+, accompanied by augmented expression of proliferation markers and decrease in transcripts of genes related to energy metabolism and cellular organization. Transgenic mice that overexpress the ?+ isoform developed heart failure spontaneously, and the same pattern of deregulated gene expression reported in the myocardial infarction model. Due to the influence in genes related to cell cycle, we quantified Mef2c?+ and Mef2c?- transcripts in cardiac myoblasts H9c2 through differentiation in vitro. We observed that Mef2c?+ is significantly reduced through differentiation, accompanied by increase in ?-. Because of the relevance of the gamma region, we investigated splicing factors that could be involved in the regulation of the alternative splicing of the gamma domain employing in silico analysis. Through that approach we identified RBFOX1, RBFOX2, CELF1 and CELF2 as potentially involved in that regulation. Essays employing a minigene system that transcribes the region subjected to the alternative splicing in mammalian cells revealed that the splicing factor RBFOX1 was able to significantly alter the relative quantification of Mef2c?+ e Mef2c?- transcripts, promoting the inclusion of the gamma domain during alternative splicing. Site-directed mutagenesis in the recognition motifs located close to the gamma domain were not able to revert that result. RBFOX2 factor showed tendency to decrease the inclusion of gamma and promoted significant increase in Mef2c?- transcripts. Concerning CELF splicing factors, CELF2 apparently had no influence. Taken together, the results of this study support the notion that the presence of gamma domain in MEF2C is associated with the pathological cardiac remodeling in heart failure and present factors possibly involved in the regulation of the alternative splicing of the ? domainMestradoFisiopatologia MédicaMestra em CiênciasCAPES88887.145717/2017-00[s.n.]Franchini, Kleber Gomes, 1961-Oliveira, Juliana Ferreira deNadruz Junior, WilsonUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Fisiopatologia MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASVaggione, Maria Luísa Boldim, 1994-20192019-10-22T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (83 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637962VAGGIONE, Maria Luísa Boldim. Mecanismos de splicing alternativo do fator de transcrição MEF2C: implicação na patogênese da insuficiência cardíaca . 2019. 1 recurso online (83 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637962. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1097836Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2020-02-06T16:01:56Zoai::1097836Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2020-02-06T16:01:56Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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