Estudo do papel da ARHGAP21 durante a diferenciação megacariocítica e no processo hemostático

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bernusso, Vanessa Aline, 1980-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/2414
Resumo: Orientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Mariana Lazarini
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spelling Estudo do papel da ARHGAP21 durante a diferenciação megacariocítica e no processo hemostáticoStudy of the role of ARHGAP21 during megakaryocytic differentiation and in the hemostatic processPlaquetas (Sangue)Diferenciação megacariocíticaCitoesqueletoProteínas rho de ligação ao GTPPlateletsMegakaryocytic differenciationCytoskeletonGTP binding proteins of the rhoOrientadores: Sara Teresinha Olalla Saad, Mariana LazariniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A reorganização do citoesqueleto mediada pela família de proteínas Rho GTPases é essencial durante a diferenciação do megacariócito e formação de plaquetas. As diferentes funções plaquetárias também dependem da intensa reorganização do citoesqueleto. As proteínas RhoGAP, como ARHGAP21, atuam como reguladores negativos de Rho GTPases, acelerando sua inativação. Nosso grupo de pesquisa reportou a participação da ARHGAP21 na regulação de funções de células-tronco e progenitores hematopoiéticos, incluindo seu comprometimento nas células progenitoras megacariocíticas. No presente estudo, investigamos o papel da ARHGAP21 na diferenciação megacariocítica e função plaquetária. Para tal, utilizamos dois modelos: 1) células de eritroleucemia humana (HEL) silenciadas para ARHGAP21 e submetidas à diferenciação megacariocítica in vitro e 2) camundongos heterozigotos nocautes para Arhgap21 (Arhgap21+/-). Proteínas do citoesqueleto foram investigadas por microscopia confocal e western blot em células HEL silenciadas para ARHGAP21 e submetidas à diferenciação megacariocítica. Marcadores de diferenciação e ploidia foram avaliados por citometria de fluxo. O modelo de camundongo Arhgap21+/- foi usado para avaliar a diferenciação megacariocítica de células progenitoras primárias. O tempo de oclusão do vaso e a formação de trombo foram detectados após lesão da artéria carótida de camundongo Arhgap21+/- com FeCl3. Agregação plaquetária e exposição à p-selectina da Arhgap21+/- foram avaliados em resposta à trombina com um agregômetro. A morfologia plaquetária foi avaliada por microscopia eletrônica. A expressão da ARHGAP21 foi aumentada durante a diferenciação megacariocítica na linhagem celular e células primárias de camundongo. No modelo de células HEL, a proteína ARHGAP21 foi detectada nas protrusões citoplasmáticas colocalizada e associada à tubulina ? e foi detectada principalmente na fração celular proteica contendo a tubulina polimerizada. O silenciamento da ARHGAP21 diminuiu a expressão da tubulina glu, sugerindo instabilidade dos microtúbulos e maior espalhamento com aumento de protrusões celulares. Ainda, em células HEL, o silenciamento da ARHGAP21 aumentou a atividade de CDC42, enquanto não foram observadas alterações na atividade de RHOA. Em modelo de camundongo Arhgap21+/-, observamos aumento de agregação plaquetária in vitro induzida por trombina e exposição à p-selectina. Houve maior atividade de RHOA e CDC42 em células primarias da medula óssea de Arhgap21+/- submetidas a diferenciação megacariocítica em comparação a células selvagens. Plaquetas Arhgap21+/- também apresentaram aumento no tamanho de grânulos ?. Estes resultados foram associados com o menor tempo de sangramento caudal e aceleração de formação de trombo após injuria da artéria carótida com FeCl3. Nossos resultados indicam que ARHGAP21 é uma proteína crítica na regulação da produção e função plaquetária por meio do controle do rearranjo do citoesqueletoAbstract: Cytoskeleton reorganization mediated by the Rho family of GTPases is an essential part of megakaryocyte differentiation and platelet formation. The different functions of platelets also depend on the intense reorganization of the cytoskeleton. RhoGAP proteins, such as ARHGAP21, are negative regulators of Rho GTPases and accelerate their inactivation. Our research group has reported the participation of ARHGAP21 in the regulation of the functions of hematopoietic stem progenitor cells, including its involvement in megakaryocytic lineage differentiation. In the present study, we investigated the role of ARHGAP21 in megakaryocytic differentiation and platelet function. To this end, two models were used: 1) the human erythroleukemia cell line (HEL) silenced for ARHGAP21 and subjected to megakaryocytic differentiation in vitro and 2) heterozygous knockout mice for the Arhgap21 gene (Arhgap21+/-). The HEL cell line model was used to assess cytoskeleton proteins by confocal microscopy and western blotting as well as differentiation markers and ploidy by flow cytometry. The Arhgap21+/- mouse model was used in different experiments to investigate megakaryocytic differentiation of primary progenitor cells. Vessel occlusion time and thrombus formation were detected after injury of carotid artery with FeCl3. Arhgap21+/-platelet aggregation and exposure to p-selectin in response to thrombin were obtained using an aggregometer and platelet morphology was evaluated by electron microscopy. ARHGAP21 expression was increased during megakaryocytic differentiation both in the HEL cell line and in mice primary cells. In the HEL cell line, ARHGAP21 was detected in cytoplasmic protrusions, where it colocalized and associated with ?-tubulin, and mainly detected in the protein cell fraction containing polymerized tubulin. In those cells, ARHGAP21 silencing decreased the expression of glu tubulin suggesting microtubule instability and greater spreading with increased cell protrusions. Furthermore, ARHGAP21 silencing increased CDC42 activity in the HEL cell line, whereas no change in RHOA activity was observed. Using Arhgap21+/- mouse model, we observed increased platelet aggregation in vitro induced by thrombin and higher p-selectin exposure. There was higher RHOA and CDC42 activity in Arhgap21+/- bone marrow primary cells when they were subjected to megakaryocytic differentiation in comparison with wild-type cells. Arhgap21+/- platelets showed an increase in the size of ? granules. These results were associated with shorter tail bleeding time and accelerated thrombus formation after injury of carotid artery with FeCl3. Our results indicate that ARHGAP21 may be a critical protein in regulating platelet production and function through the control of cytoskeleton rearrangementDoutoradoFisiopatologia MédicaDoutora em CiênciasFAPESP2013/13022-2[s.n.]Saad, Sara Teresinha Olalla, 1956-Lazarini, Mariana, 1982-Kobarg, JörgZorzetto, Nicola Amanda ConranBassères, Daniela SanchezBorges, LucieneUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Fisiopatologia MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBernusso, Vanessa Aline, 1980-20212021-11-10T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (94 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/2414BERNUSSO, Vanessa Aline. Estudo do papel da ARHGAP21 durante a diferenciação megacariocítica e no processo hemostático. 2021. 1 recurso online (94 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/2414. 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