Caracterização funcional de um transportador de fosfolipídios de "Leishmania braziliensis" : investigação do possível envolvimento na suscetibilidade à miltefosina = Functional characterization of a phospholipid transporter of "Leishmania braziliensis": possible role in susceptibility to miltefosine

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Saborito da Silva, Cristiele, 1993-
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/13853
Resumo: Orientador: Adriano Cappellazzo Coelho
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Há duas principais formas da doença, a leishmaniose visceral e tegumentar, as quais estão associadas a espécies distintas do parasito. O tratamento para a leishmaniose no Brasil está limitado ao uso de três fármacos principalmente: os antimoniais pentavalentes, a anfotericina B e a pentamidina. Entretanto, estes possuem limitações quanto ao alto custo, toxicidade e abandono do tratamento pelo paciente, visto que a administração destes fármacos é parenteral, exigindo hospitalização. Como nova alternativa de tratamento da leishmaniose tegumentar no Brasil, foi aprovada a miltefosina (MF), fármaco de uso oral e de efeitos colaterais leves. Para o tratamento da leishmaniose visceral na Ásia, a MF apresenta taxas de cura de cerca de 90%, enquanto que as taxas de curas para a leishmaniose tegumentar no Brasil são de 70%. Sabe-se que a atividade do fármaco contra o parasito é dependente de um transportador de fosfolipídios, localizado na membrana plasmática do parasito e conhecido como transportador de miltefosina (MT). No Brasil, Leishmania (Viannia) braziliensis é a principal espécie causadora da leishmaniose tegumentar. Neste projeto, foi proposto a caracterização da função deste transportador e a avaliação de sua possível relação com a suscetibilidade e resistência à MF em L. (V.) braziliensis, utilizando ferramentas de manipulação genética do parasito. Os resultados provenientes do sequenciamento do genoma de L. (V.) braziliensis, realizado por meio das tecnologias Nanopore e Illumina, evidenciaram a existência de três cópias do gene MT com alta similaridade entre a sequência de aminoácidos. Além disso, foi observado que este gene se encontra em três unidades de duplicação de cerca de 8,5 kb cada, contendo o gene MT e o gene LbrM.13.1390, que codifica uma proteína hipotética. Através de estratégias de superexpressão e nocaute do gene MT, foi possível correlacionar o fenótipo de suscetibilidade à MF com o gene MT de L. (V.) braziliensis. As linhagens superexpressoras deste gene mostraram-se mais suscetíveis ao fármaco, enquanto que as linhagens nocaute de L. (V.) braziliensis mais resistentes. Uma correlação direta foi observada entre a suscetibilidade à MF das linhagens transgênicas e o acúmulo da droga fluorescente, um análogo fluorescente de MF. Os ensaios de localização celular do MT de L. (V.) braziliensis demonstraram que o transportador estava localizado no citoplasma do parasito, diferentemente do reportado em outras espécies. Em conclusão, os resultados obtidos demonstraram que o MT é essencial para a atividade do fármaco em L. (V.) braziliensis, sendo uma importante via de acúmulo da drogaAbstract: Leishmaniasis is a neglected tropical disease endemic in almost 100 countries, caused by the parasitic protozoa Leishmania and transmitted by infected sandfly vectors. There are two main forms of the disease, visceral and tegumentary leishmaniasis, which are associated with distinct species of the parasite. Treatment for leishmaniasis in Brazil is limited to the use of three mainly drugs: pentavalent antimonial, amphotericin B and pentamidine. However, they have limitations regarding the high cost, toxicity and abandonment of treatment by the patient, since the administration of these drugs is parenteral, requiring hospitalization. As an alternative treatment for tegumentary leishmaniasis in Brazil, miltefosine (MF) was approved, a drug for oral use and mild side effects. For the treatment of visceral leishmaniasis in Asia, miltefosine has cure rates of around 90%, while the cure rates for tegumentary leishmaniasis in Brazil are 70%. It is known that the drug's activity against the parasite is dependent on a phospholipid transporter, located on the parasite's plasma membrane and known as miltefosine transporter (MT). In Brazil, Leishmania (Viannia) braziliensis is the main species causing tegumentary leishmaniasis. In this project, it was proposed to characterize the function of this transporter and evaluate its possible relationship with susceptibility and resistance to miltefosine in L. (V.) braziliensis, using tools of parasite genetic manipulation. Results from whole genome sequencing of L. (V.) braziliensis, performed through Nanopore and Illumina technologies, evidenced the existence of three copies of MT gene with high similarity among amino acids sequences. Additionally, it was observed that this gene is found in three duplication units around 8.5 kb, containing MT gene and LbrM.13.1390, coding to a hypothetical protein. Through strategies of MT gene overexpression and knockout, it was possible to directly correlate MT gene to the phenotype of MF susceptibility in L. (V.) braziliensis. The overexpressed lines showed higher susceptible to the drug, while knockout lines of L. (V.) braziliensis showed higher resistant. A direct correlation it was observed between susceptibility to MF of transgenic lines and accumulation of fluorescent drug, a fluorescent analog of MF. Cell localization assay for MT from L. (V.) braziliensis showed that the transporter was in the parasite's cytoplasm. In conclusion, the obtained data demonstrated that the MT is essential to the drug activity in L. (V.) braziliensis, being an important route of drug accumulationMestradoGenética de MicroorganismosMestra em Genética e Biologia MolecularFAPESP2021/00171-6CAPES001[s.n.]Coelho, Adriano Cappellazzo, 1978-Silva, Maria Fernanda Laranjeira daMenossi, MarceloUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSaborito da Silva, Cristiele, 1993-20232023-09-18T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (115 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/13853SABORITO DA SILVA, Cristiele. Caracterização funcional de um transportador de fosfolipídios de "Leishmania braziliensis": investigação do possível envolvimento na suscetibilidade à miltefosina = Functional characterization of a phospholipid transporter of "Leishmania braziliensis": possible role in susceptibility to miltefosine. 2023. 1 recurso online (115 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/13853. 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