Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Aidar, Marisi, 1958-
Data de Publicação: 2006
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602808
Resumo: Orientador: Sergio Roberto Peres Line
id UNICAMP-30_ec8934b877c8dd9877ef714e9f8dc25c
oai_identifier_str oai::368826
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonioDNA purification from buccal epithelial cells by ammonium acetate methodDNAReação em cadeia da polimeraseMucosa bucalPolymerase chain reactionMouth mucosaOrientador: Sergio Roberto Peres LineDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Células bucais são fontes convenientes de DNA para diagnóstico e estudos epidemiológicos. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um método simples e prático para obter células epiteliais, através de bochechos, a fim de serem usadas como fonte de DNA, avaliar a estabilidade do DNA na solução de bochecho no decorrer do tempo e analisar a eficácia deste método na amplificação por PCR de fragmentos de diferentes comprimentos. Os procedimentos usados neste estudo evitam o uso de solventes orgânicos permitindo uma prática laboratorial mais segura. Isto é alcançado pela remoção das proteínas celulares por desidratação e precipitação com uma solução de acetato de amônio 8 M. Bochechos com 5 mL de dextrose 3% foram coletados de 65 indivíduos. Adicionados a cada amostra 3 mL de solução TNE [17 mM Tris-HCL (pH 8,0), 50 mM NaCl, 7 mM EDTA] diluído em etanol 66%. O conteúdo das amostras de bochechos de 20 indivíduos foi dividido em 4 tubos. Um tubo foi usado para extração imediata (igualmente às demais 45 amostras) e os três tubos restantes foram mantidos em temperatura ambiente por períodos de 2, 15 e 30 dias, seguidos pela extração do DNA. As células bucais foram centrifugadas e ressuspendidas em solução contendo 10 mM Tris (pH 8.0), 0.5% SDS, 5 mM EDTA e proteinase K (20 mg/mL). Após incubação a 55ºC durante toda a noite as proteínas foram removidas pela adição de acetato de amônio 8 M seguida por centrifugação. O DNA foi precipitado com isopropanol e ressuspendido em 10 mM Tris (pH 7.8) e 1 mM EDTA. Foram realizadas reações de PCR com primers específicos para fragmentos dos seguintes genes: PAX9 (202 pb); KLK (555 pb); MMP20 (1434 pb). Nossas análises fornecem evidências consistentes de que o produto de DNA extraído por esta metodologia é suficiente para diversas amplificações por PCR. Fragmentos grandes de DNA (1434 pb) puderam ser obtidos com sucesso. Além disso, com a adição de TNE/Etanol o DNA é eficientemente preservado na solução de bochecho, a qual pode ser estocada em temperatura ambiente por até trinta dias, o que possibilita a coleta em campo e contribui para o aumento da amostragem. Este protocolo permite a extração de maneira rápida, simples, econômica e garante o processamento de várias amostras ao mesmo tempoAbstract: Buccal cells provide a convenient source of DNA for diagnosis and epidemiological studies. The goal of this study was to develop a convenient method to obtain buccal cells from mouthwash samples to be used as a source of DNA, and to evaluate the stability of the DNA in the mouthwash solution over time. Finally, we analysed if the methodology could be used for PCR amplification of high molecular mass fragments. The procedures used in this paper avoid the use of any organic solvent. This is achieved by salting out the cellular proteins by dehydration and precipitation with a 8 M ammonium acetate solution. A group of 65 consenting subjects undertook a mouthwash containing 5mL of 3% dextrose solution. Three mL of TNE solution [17 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl and 7 mM EDTA] diluted in 66% ethanol, was added to the tube. The mouthwash solution of 20 individuals was divided into 4 tubes. One tube was used for immediate extraction (equally to the others 45 samples) and the three remaining were kept at room temperature for periods of 2, 15 and 30 days, followed by DNA isolation. Buccal cells were pelleted and resuspended in a solution containing 10 mM Tris (pH 8.0), 0.5% SDS, 5 mM EDTA, and proteinase K (20 mg/mL). After overnight incubation at 55°C proteins were removed by adding 8 M ammonium acetate followed by centrifugation. DNA was precipitated with isopropanol and resuspended in 10 mM Tris (pH 7.8) and 1 mM EDTA. PCR amplifications were performed. Three pairs of primers were used: PAX9 (202 pb); KLK (555 pb); MMP20 (1434 pb). Our analyses provided consistent evidences that DNA yield extracted by this methodology is sufficient for several PCR amplifications. Large size products (1434 bp) could be successfully obtained. Additionally, dilution of the mouthwashes in TNE/ethanol prevented DNA degradation at room temperature for periods of up to 30 days, allowing safe storage and transport of field specimens collected in isolated communities, distant from the laboratory. On conclusion, the protocol described here is quick, simple to perform, sensitive, economical and several samples can be processed at the same timeMestradoHistologia e EmbriologiaMestre em Biologia Buco-Dental[s.n.]Line, Sergio Roberto Peres, 1963-Gonçalves, Edmilson RicardoDella Coletta, RicardoUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de PiracicabaPrograma de Pós-Graduação não informadoUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASAidar, Marisi, 1958-20062006-05-06T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf30f. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602808AIDAR, Marisi. Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio. 2006. 30f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602808. Acesso em: 14 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/368826porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T04:33:21Zoai::368826Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T04:33:21Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
DNA purification from buccal epithelial cells by ammonium acetate method
title Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
spellingShingle Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
Aidar, Marisi, 1958-
DNA
Reação em cadeia da polimerase
Mucosa bucal
Polymerase chain reaction
Mouth mucosa
title_short Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
title_full Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
title_fullStr Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
title_full_unstemmed Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
title_sort Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio
author Aidar, Marisi, 1958-
author_facet Aidar, Marisi, 1958-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Line, Sergio Roberto Peres, 1963-
Gonçalves, Edmilson Ricardo
Della Coletta, Ricardo
Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Programa de Pós-Graduação não informado
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Aidar, Marisi, 1958-
dc.subject.por.fl_str_mv DNA
Reação em cadeia da polimerase
Mucosa bucal
Polymerase chain reaction
Mouth mucosa
topic DNA
Reação em cadeia da polimerase
Mucosa bucal
Polymerase chain reaction
Mouth mucosa
description Orientador: Sergio Roberto Peres Line
publishDate 2006
dc.date.none.fl_str_mv 2006
2006-05-06T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv (Broch.)
https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602808
AIDAR, Marisi. Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio. 2006. 30f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602808. Acesso em: 14 mai. 2024.
identifier_str_mv (Broch.)
AIDAR, Marisi. Extração do DNA genomico a partir de celulas epiteliais bucais utilizando acetato de amonio. 2006. 30f. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602808. Acesso em: 14 mai. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602808
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/368826
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
30f. : il.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1799138413596639232

Registros relacionados