Produção do lipopeptídeo surfactina a partir de uma cepa de Bacillus subtilis com o operon srfA sob controle do promotor regulado Pgrac

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Moraes, Diane Téo de
Data de Publicação: 2010
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1613700
Resumo: Orientador: Gláucia Maria Pastore
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O conjunto multienzimático, responsável pela síntese da surfactina, consiste de três grandes NRPSs: SrfA-A (402kDa), SrfA-B (401kDa) e SrfA-C (144 kDa), compreendendo um total de sete módulos. Os genes NRPSs correspondentes estão organizados no operon srfA. A produção de surfactina por B.subtilis é usualmente baixa e a produção em sistemas de expressão heterólogos como E.coli não é viável. Portanto, uma opção para aumentar a produção de surfactina seria o uso de sistemas de expressão utilizando o próprio Bacillus, colocando o operon srfA sob controle de um forte promotor que pode funcionar independentemente da regulação por feedback negativo endógeno. Para esta proposta, o promotor nativo do operon responsável pela síntese da surfactina em B.subtilis LB5a foi substituído pelo promotor Pgrac, o qual pode ser induzido por análogos de lactose. Este sistema de expressão é baseado em um forte promotor que não é inibido por fatores endógenos e, deve fornecer uma nova ferramenta para produzir altos níveis de surfactina em Bacillus subtilis. A eficácia do lipopeptídeo produzido pela cepa recombinante de B.subtilis pGrac-SrfA foi demonstrada usando testes de atividade hemolítica e avaliação da tensão superficial do meio. Os picos do lipopeptídeo obtido por HPLC para a cepa recombinante pGrac-SrfA apresentaram perfis semelhantes aos obtidos a partir da cepa selvagem. Análises de espectrometria de massas confirmaram a presença de uma série homóloga de lipopeptídeos com variações no tamanho da cadeia hidrocarbônica caracterizando o composto como surfactina. Verificou-se a predominância do homólogo de massa molecular de 1000,18 u. A produção de surfactina pela cepa de B.subtilis recombinante foi cerca de 57% superior ao da cepa selvagem, quando induzida por isopropil b-D-1-tiogalactopiranosídeoAbstract: The cyclic lipoheptapeptide surfactin is produced by different Bacillus subtilis strains. At a concentration of 20µM, this biosusrfactant is able to reduce the surface tension of water from 72 mN/m to 27 mN/m. This makes surfactin one the most powerful biosurfactants known so far. The surfactin synthetase is a large multienzyme complex consisting of three enzymatic subunits, SrfA (402 kDa), SrfB (401 kDa), and SrfC (144 kDa), comprising of a total of seven modules. The corresponding NRPS genes are organized in the srfA operon. Surfactin production from Bacillus strains is usually low and production of such large proteins in a heterologous system such as E. coli is not viable. One option to improve surfactin production would be to use Bacillus subtilis itself as an expression system and to place the srfA operon under the control of a strong promoter that can function independently of endogenous negative feedback regulation. For this purpose, the native promoter of the surfactin operon in B.subtilis LB5a was replaced by the promoter Pgrac, which can be induced by lactose analogs. This expression system is based on a strong promoter and is not expected to be inhibited by endogenous factors and, should provide a new tool for producing higher levels of surfactin in Bacillus subtilis.The efficacy of the lipopeptide produced for the recombinant B.subtilis pGrac-SrfA was demonstrated using tests of hemolytic activity and evaluation of the surface tension of the medium. HPLC peaks of surfactin gotten of the genetically modified strain showed patterns of lipopeptides similar to those of the wild-type strain, and mass spectrometry analysis confirmed the presence of a lipopeptide homologous serie with variations in the hydrocarbon chain length, known as surfactin. Was verified the predominance of a homologue with a molecular mass of 1000.18 u. The surfactin production of the recombinant bacterium was up to about 57% greater than that of wild-type strain when it was induced by isopropyl b-D-1-thiogalactopyranosideDoutoradoDoutor em Ciência de Alimentos[s.n.]Pastore, Glaucia Maria, 1953-Sato, Helia HarumiPereira, Karen SignoriSquina, Fabio MarcioSantos, Rosângela dosUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia de AlimentosPrograma de Pós-Graduação em Ciência de AlimentosUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASMoraes, Diane Téo de2010info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf90 f. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1613700MORAES, Diane Téo de. Produção do lipopeptídeo surfactina a partir de uma cepa de Bacillus subtilis com o operon srfA sob controle do promotor regulado Pgrac. 2010. 90 f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1613700. 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