Purificação em etapa cromatográfica única de DNA plasmidial a partir do lisado neutralizado visando a sua aplicação em estudos de terapia e vacinação gênica

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bonturi, Nemailla, 1985-
Data de Publicação: 2011
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1615851
Resumo: Orientadores: Everson Alves Miranda, Adriano Rodrigues Azzoni
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spelling Purificação em etapa cromatográfica única de DNA plasmidial a partir do lisado neutralizado visando a sua aplicação em estudos de terapia e vacinação gênicaSingle step chromatographic purification of plasmid DNA from neutralised lysate aiming its application in gene therapy and vaccinationCromatografiaPlasmídeosBiomoléculas - PurificaçãoAnálise cromatográficaChromatographyPlasmidsBiomolecules - PurificationChromatographic analysisOrientadores: Everson Alves Miranda, Adriano Rodrigues AzzoniDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuímicaResumo: O número de estudos em terapia gênica com vetores plasmídiais (pDNA) têm aumentado nestes últimos anos. Como resultado, a demanda para preparações de pDNA em conformidade com as recomendações das agências reguladoras (EMEA, FDA) também aumentou. O DNA plasmidial é frequentemente obtido através da fermentação de Escherichia coli transformada e purificada por uma série de operações unitárias, incluindo a cromatografia. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um processo cromatográfico para a recuperação e purificação do pDNA superenovelado (sc pDNA) a partir do lisado neutralizado. Os ligantes fenil (hidrofóbico) e mercaptopirimidina (tiofílico) foram imobilizados em matrizes de agarose e celulose. A seletividade destes ligantes para com o sc pDNA foi determinada através de estudos de adsorção utilizando citrato de sódio 1,5 mol/L e fosfato de potássio 2,0 mol/L como tampões de adsorção. A cromatografia com o adsorvente fenil-agarose e o citrato de sódio 1,5 mol/L permitiu recuperar 58% do pDNA sem contaminação por gDNA, proteínas e endotoxinas, sendo uma alternativa potencial para a recuperação primária do sc pDNA. O resultado mais promissor foi obtido com a cromatografia com o adsorvente mercaptopirimidina-agarose e fosfato de potássio 2,0 mol/L como tampão de adsorção. Este sistema tampão de adsorção/adsorvente permitiu a obtenção de pDNA com 100% de pureza e dentro das recomendações das agências reguladoras no tocante à contaminação por RNA e endotoxinas. Assim, este trabalho lançou as bases para o desenvolvimento de dois métodos cromatográficos para a recuperação primária ou purificação de pDNA diretamente do lisado neutralizado, ambos potencialmente aplicáveis em larga escalaAbstract: The number of studies in gene therapy with plasmid vectors (pDNA) has witnessed an increase in the recent years. As result the demand for preparations of pDNA in compliance with recommendations of the regulatory agencies (EMEA, FDA) has also increased. Plasmid DNA is oftenly obtained through fermentation of transformed Escherichia coli and purified by a series of unit operations, including chromatography. This work aimed the development of a chromatographic process for the recovery and purification of supercolied pDNA (sc pDNA) directly from neutralized cell lysate. Phenyl (hydrophobic) and mercaptopyrimidine (thiophilic) molecules immobilized in agarose and cellulose matrices were the ligands used to capture the pDNA. Their selectivity towards sc pDNA was evaluated through adsorption studies using sodium citrate 1.5 mol/L and potassium phosphate 2.0 mol/L as the adsorption buffers. The chromatography with the adsorbent phenyl-agarose and sodium citrate 1.5 mol/L was able to recover 58% of sc pDNA without gDNA, proteins and endotoxins contamination, being an potential alternative for the primary recovery of sc pDNA. The most promising result was obtained with the chromatography with mercaptopyrimidine-agarose and potassium phosphate 2.0 mol/L adsorpition buffer. With the latter buffer/adsorbent system it was possible to obtain in a single step pDNA with 100% purity and within the recommendations of regulatory agencies with regard to contamination by RNA and endotoxins. Thus, this work laid the basis for the development of two chromatographic process for the recovery or purification of pDNA directly from the neutralized lysate, both potentially applicable in larger scaleMestradoDesenvolvimento de Processos BiotecnológicosMestre em Engenharia Química[s.n.]Miranda, Everson Alves, 1959-Azzoni, Adriano Rodrigues, 1971-Bueno, Sonia Maria AlvesMaluf, Mirian PerezUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia QuímicaPrograma de Pós-Graduação em Engenharia QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBonturi, Nemailla, 1985-20112011-04-07T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf147 p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1615851BONTURI, Nemailla. Purificação em etapa cromatográfica única de DNA plasmidial a partir do lisado neutralizado visando a sua aplicação em estudos de terapia e vacinação gênica. 2011. 147 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1615851. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/804340porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T06:20:47Zoai::804340Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T06:20:47Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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