Caracterização funcional e biofísica das proteínas RVB-1 e RVB-2 pertencentes a família AAA+ do fungo Neurospora crassa

• Autor(a) principal: Campanella, Jonatas Erick Maimoni
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/153234
• topic: Estresse termico; Neurospora crassa; RVB-1; RVB-2; Electrophoretic mobility-shift assay

Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo levaram à identificação da proteína RVB-1 de Neurospora crassa como capaz de se ligar a um fragmento de DNA contendo o motif STRE (Stress Responsive Element). Este elemento de DNA, em Saccharomyces cerevisiae, é descrito estar presente na região promotora de genes responsivos a estresse, incluindo o estresse térmico. Uma busca nos bancos de dados de proteínas mostrou que a RVB-1 apresenta homologia estrutural à proteína RuvBL1 de humanos. Além disso, esta proteína é descrita possuir uma proteína paráloga, RuvBL2 ou Rvb2 de humano e S. cerevisiae, respectivamente, cuja proteína ortóloga em N. crassa foi denominada RVB-2. As proteínas RuvBLs foram encontradas estarem associadas a vários processos celulares, muito provavelmente devido as suas capacidades de formar grandes complexos proteicos e possuírem atividade ATPásica. Neste trabalho, estas proteínas foram parcialmente caracterizadas do ponto de vista funcional, bioquímico e biofísico. Os resultados obtidos por microscopia de fluorescência mostraram que ambas apresentam localização nuclear quando o fungo foi exposto a estresse térmico. A análise da expressão da proteína RVB-V5 mostrou estar aumentada, nessa mesma condição ambiental, quando analisada por Western blot. As duas proteínas foram produzidas na forma recombinante em Escherichia coli, tanto isoladamente quanto juntas, e a análise da expressão mostrou alta estabilidade em solução quando ambas foram produzidas em uma mesma célula de bactéria. Ambas mostraram interagir in vitro por análise de pulldown e o complexo RVB-1/2 mostrou ser formado principalmente por α-hélices através de espectropolarimetria de dicroísmo circular. Análise em gel filtração analítica sugeriu que o complexo apresenta diferentes estruturas oligoméricas, quando analisado na ausência e na presença de ATP. O complexo apresentou atividade ATPásica in vitro, o que fortemente sugere que ambas pertencem à família AAA+. Resultados de retardamento em gel de agarose (EMSA), mostraram que tanto separadamente, como na forma de complexo, essas proteínas são capazes de se ligar a fragmentos de DNA dupla fita independentemente de ATP.