Avaliação de mediadores da via de sinalização do fator de necrose tumoral alfa e de microRNAs em câncer gástrico e efeito do silenciamento de seus receptores

• Autor(a) principal: Freire, Ana Flávia Teixeira Rossi
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNESP
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11449/183177
• topic: Câncer gástrico; Via de sinalização de TNF-α; Silenciamento de TNFR1; Silenciamento de TNFR2; MiRNAs; Helicobacter pylori; Gastric cancer; TNF-α signaling pathway; TNFR1 knockdown; TNFR2 knockdown

Introdução: Câncer gástrico (CG) apresenta altas taxas de incidência e mortalidade no mundo, sendo a infecção persistente pela bactéria Helicobacter pylori (H. pylori) um dos seus principais fatores etiológicos, uma vez que promove inflamação crônica e a expressão de mediadores inflamatórios, como o fator de necrose tumoral (TNF)- α. Esta citocina é um mediador chave entre inflamação e câncer, induzindo múltiplas respostas celulares por meio de dois receptores: TNFR1 e TNFR2. Ambos os receptores podem desencadear a sobrevivência, mas apenas TNFR1 é capaz de induzir morte celular. A regulação desta via é complexa e pode ser alterada por microRNAs (miRNAs) podendo favorecer o processo tumorigênico. Objetivos: a) avaliar a expressão de genes e miRNAs envolvidos na via de sinalização de TNF-α e suas relações em amostras de CG; b) construir uma rede de interação miRNAsRNAm; c) avaliar o efeito do silenciamento dos receptores TNFR1 e TNFR2 e do tratamento com extrato da H. pylori (eHP), na expressão dos mesmos genes e miRNAs, bem como nos processos celulares de proliferação, ciclo celular e apoptose em linhagem de câncer gástrico. Materiais e Método: Total de 30 amostras provenientes de indivíduos com CG foram submetidas a PCR quantitiva (qPCR) com ensaios TaqMan®, para quantificação relativa (RQ) do RNAm de genes da via de sinalização de TNF-α (TNFA, TNFR1, TNFR2, TRADD, TRAF2, CFLIP, NFKB1, NFKB2, CASP8, CASP3) e de miRNAs que apresentam alguns destes RNAm como alvo (miR-19a, miR-34a, miR-103a, miR-130a, miR-181c). Odiagnóstico molecular da H. pylori foi realizado por nested PCR para o gene HSP60. Linhagens de adenocarcinoma gástrico AGS estáveis contendo os receptores TNFR1 (AGS-shR1) e TNFR2 (AGS-shR2) silenciados por shRNAs específicos e linhagem AGS não silenciada foram tratadas com 30% v/v de eHP por 6 horas. Posteriormente, foi realizada a quantificação dos mesmos RNAm e miRNAs por qPCR, ensaio MTT para avaliação da proliferação celular e citometria de fluxo para análise do ciclo celular e apoptose. Resultados: Nas amostras de CG houve aumento na expressão de genes pró-sobrevivência (TNF, TNFR2, TRADD, TRAF2, CFLIP e NFKB2), CASP8 e do miR-34a, enquanto a expressão de mediadores pró-apoptóticos (TNFR1 e CASP3) estava reduzida. Infecção pela H. pylori não influenciou a expressão dos RNAm e miRNAs nas amostras de CG. A rede de interação miRNA:RNAm mostrou possíveis interrelações entre os miRNAs analisados e os genes da via de sinalização de TNF-α, destacando os miR-19a e miR-103a que podem regular o maior número de genes. Nos experimentos in vitro, AGS-shR1 apresentou redução significante na expressão de genes de sobrevivência celular (TNFA, NFKB1 e NFKB2) e aumento na expressão de CASP3, embora não alterou a expressão de miRNAs e nem os processos celulares. Por outro lado, silenciamento parcial de TNFR2 reduziu significantemente a expressão de TRADD e TRAF2, assim como aumentou a expressão de miRNAs, suprimiu a apoptose e desencadeou parada do ciclo celular na fase G2/M. Tratamento com eHP na linhagem não silenciada, além de aumentar o número de células em necrose, aumentou a expressão dos genes TNFR1, NFKB1, NFKB2 e CFLIP, e reduziu a expressão de TNFR2, embora expressão reduzida dos receptores tenha diminuido a intensidade da resposta ao tratamento. Conclusão: Portanto, nossos resultados destacam o importante papel da via de sinalização de TNF-α mediada tanto por TNFR2 como por TNFR1 em câncer gástrico. Em amostras de tecido, o efeito pró-tumoral de TNF-α deve-se a ativação da via de sinalização mediada principalmente por TNFR2. Na linhagem celular, silenciamento parcial de TNFR1 e TNFR2 reduziu a expressão de genes pró-sobrevivência e anti-apoptóticos e afetou processos celulares e expressão de miRNAs, de modo que silenciamento simultâneo dos receptores pode ter um efeito anti-tumoral em câncer gástrico. Além disto, a resposta de infecção por H. pylori nesta via de sinalização é mediada principalmente por TNFR1, direcionando para a via de sobrevivência celular.