Avaliação in silico de sítios de inserção em Genomic Safe Harbors para uso do sistema CRISPR/Cas9 em diferentes populações humanas

• Autor(a) principal: Carneiro, Paola Barcelos
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/257947
• topic: CRISPR-Cas9; Terapia gênica

A inserção de transgenes com expressão não transiente e com minimização de efeitos adversos na funcionalidade celular do organismo tem grande importância no âmbito clínico, fornecendo recurso terapêutico aos pacientes com tratamento de eficácia limitada ou tratamentos que dependem de doadores compatíveis. Nesse cenário, a inserção de produtos terapêuticos dentro de Genomic Safe Harbors (GSH) usando o sistema CRISPR/Cas9 promove uma alternativa terapêutica para aplicação a distintas doenças genéticas, prevendo antecipadamente a interação do transgene no genoma humano. Contudo, avaliações sobre a arquitetura tridimensional do genoma e efeitos off-target considerando a variabilidade genética levantam o questionamento da segurança do tratamento em diferentes tipos celulares e populações humanas. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a organização tridimensional cromossômica em três tipos celulares como também efeitos off-targets a partir da probabilidade de clivagem dessas regiões para sgRNAs desenhados em GSH usando ferramentas desenvolvidas para acesso aos dados de variantes genéticas contidos em diferentes bancos. A investigação de sítios de inserção em 4 loci GSH (AAVS1, H11, SH6 e THUMPD3-AS1) demonstrou que THUMPD3-AS1 está dentro de um potencial Topological Associate Domains (TAD) conservado ao longo dos diferentes tipos celulares. Entretanto, TADs foram apenas estabelecidos para demais loci para tipos celulares específicos devido à baixa resolução de dados. Ainda, a avaliação de off-target questiona a segurança da aplicação do mesmo sgRNA ao longo de diferentes populações humanas em GSH devido a off-target privados e compartilhados adjacentes a existentes ou criadas PAM canônicas. Dentre todas as populações, a população Africana (n = 256) seguindo da população Brasileira (n = 220) demonstraram o maior número de sítios polimórficos que criam PAMs canônicas considerando todos os sgRNAs. Com intuito de minimização de efeitos off-target, o sgRNA5 para AAVS1 com menor número dessas regiões demonstrou que sítios polimórficos diminuem a probabilidade de clivagem, demonstrando menor efeitos off-target para população Latina que apresenta o maior número de sítios polimórficos (n = 302). Finalmente, ferramentas para acesso de dados variantes genéticas foram desenvolvidas para auxiliar futuras investigações sobre a variabilidade genética das populações nos bancos gnomAD e ABraOM. Espera-se que a análise conduzida para sítios de inserção em GSH ajudem na aplicação de tratamentos terapêuticos na clínica para doenças genéticas distintas em diferentes populações.