Caracterização de partículas virais e RNA de dupla fita isolados do fungo entomopatogênico Matarhizium anisopliae

• Autor(a) principal: Giménez-Pecci, María de la Paz
• Data de Publicação: 1996
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/164625
• topic: Vírus; RNA

Micovírus são freqüentemente encontrados infectando vários gêneros de fungos. Em alguns sistemas, bem caracterizados, foi demonstrada a interferência de genes virais com o fenótipo do fungo, sendo o caso melhor documentado a hipovirulência em fungos fitopatogênicos. Em nosso laboratório, seis linhagens de Metarhizium anisopliae, um fungo entomopatogênico usado no controle biológico de pragas importantes em agricultura, foram analisadas para a presença de dsRNA. Todas as linhagens foram isoladas de insetos e três apresentam dsRNA viral (linhagens Al, MS e RJ). Nosso objetivo é analisar a possível interferência dos micovírus (Ma V s) com a entomopatogenicidade de M anisopliae. Neste trabalho foram caracterizados três MaVs através de purificação em gradientes de CsCl, microscopia eletrônica, análise de proteínas, padrão eletroforético dos componentes dsRNA, sorologia e análise da homologia entre os componentes dsRNA individuais de um mesmo Ma V e entre os componentes dsRNA dos diferentes MaVs, utilizando sondas de cDNA. As partículas virais dos MaVs RJ, AI e MS são isométricas, com diâmetro médio de 3S nm e são separados em várias bandas em gradientes de CsCI nas densidades de flotação de 1,32 a 1,41 (MaV-RJ); 1,3S a 1,45 (MaV-Al) e 1,40 a 1,43 g/ml (MaV-MS). Espectros de absorção típicos de nucleoproteínas foram observados em todas estas bandas e nas preparações de micovírus. Após a dissociação das partículas virais foi observada a presença de componentes dsRNA com o mesmo perfil eletroforético obtido em extratos de micélio. Foi demonstrado que o ácido nucléico viral é composto por dsRNA, pela digestão enzimática específica e purificação em colunas de celulose CFll. MaV-RJ apresenta, pelo menos, treze componentes dsRNA, variando de 3,1 a 0,5 kb e um polipeptídeo majoritário do capsídeo de 46 kDa. Ma V-AI apresenta pelo menos, cinco componentes dsRNA variando de 4,1 a 1 kb e um polipeptldeo majoritário do capsídeo de 80 kDa. Ma V -MS é muito semelhante a Ma V -AI em relação ao componente dsRNA de 4,1 kb e polipeptídeo majoritário, entretanto apresenta um número menor de componentes dsRNA pequenos. Durante o desenvolvimento do trabalho, Ma V-AI e MaV-MS apresentaram um padrão instável de componentes dsRNA, progressivamente mais complexo em relação aos componentes dsRNA pequenos. Foi caracterizado um mutante estável (linhagem RJd), derivado espontaneamente da linhagem RJ que não apresenta os componentes dsRNA de maior peso molecular, tendo apenas os nove componentes menores presentes na linhagem parental RJ. Esta linhagem derivada, RJd, apresenta morfologia da colônia alterada, contudo não temos evidências experimentais para associar diretamente estas alterações com o padrão alterado de componentes dsRNA. Anticorpos policlonais foram produzidos contra os três Ma V s e mostramos que estes Ma V s são sorologicamente relacionados. Em testes de dupla difusão MaV-RJ reage com antisoro contra MaV-AL e MaV-M5 indicando relações sorológicas. Em Western, todos os polipeptídeos dos capsídeos dos três Ma V s, reagem com os antisoros contra MaV-Al e MaV-M5. Sondas de cDNA do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al hibridizam com os componentes de 4,1 kb de MaV-M5 e com os componentes dsRNA S2, M3 e Ml de MaV-RJ. Quando a sonda de cDNA é preparada a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-M5 também ocorre hibridização com o componente dsRNA de mesmo tamanho de MaV-AL ~com o componente dsRNA S2 de MaV-RJ. Se conclui que os três micovírus são relacionados entre si em relação a pelo menos um componente dsRNA. Além disso, a análise de hibridização mostrou que existe homologia entre todos os componentes de Ma V-RJ mas sondas a partir do componente dsRNA de 4,1 kb de MaV-Al não hibridizam com nenhum outro componente da mesma linhagem. Nossas tentativas de transferir micovírus ou dsRNA a linhagens "livres de micovírus" utilizando biobalística falharam.