Desenvolvimento e avaliação de imunobiológicos para o diagnóstico sorológico de arboviroses

• Autor(a) principal: Pereira, Samuel Santos
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-15072024-145720/
• topic: Dengue; Dengue; Diagnóstico sorológico; Domain III (EDIII); Domínio III (EDIII); Non-structural protein 1 (NS1); Proteína Não Estrutural 1 (NS1); Serological diagnosis

O vírus Dengue pertence à família Flaviviridae sendo de relevante impacto na saúde pública mundial. O diagnóstico laboratorial é uma importante ferramenta para a identificação específica dos casos de dengue. Os testes sorológicos para detecção de anticorpos IgM e IgG são amplamente utilizados no diagnóstico laboratorial da dengue. No entanto, devido à elevada semelhança antigênica entre os Flavivírus, há forte comprometimento da especificidade dos testes sorológicos comerciais. Além disso, a re-emergência de alguns Flavivírus, como o vírus Zika, torna o diagnóstico laboratorial desafiador. O objetivo desse trabalho foi avaliar imunobiológicos recombinantes derivados das proteínas Não Estrutural 1 (NS1) e do Envelope (E) dos DENVs 1-4 para o diagnóstico sorológico de infecções prévias pelos DENVs. Os antígenos recombinantes &#916NS1 e EDIII foram construídos a partir das proteínas NS1 e E dos DENVs 1-4. Esses antígenos foram expressos em Escherichia coli e purificados por cromatografia. A antigenicidade foi confirmada por ELISA com soros anti-DENV, demonstrando que as proteínas obtidas preservam epítopos semelhantes aos das proteínas nativas. Inicialmente, avaliamos a combinação das proteínas &#916NS1 DENVs para diagnóstico da dengue na plataforma de ELISA. Os resultados dos testes indicaram sensibilidade de 79-82% e especificidade de 79-93%. Desenvolvemos também um antígeno poliepítopo baseado na fusão das &#916NS1 dos quatro tipos de DENV e denominado de T-&#916NS1. Essa proteína foi expressa, purificada e reconhecida por soros anti-DENV. A performance da T-&#916NS1 em ensaio de ELISA determinou sensibilidade de 77,42% e especificidade de 88,57%. Ao final, investigamos o uso da combinação das proteínas EDIII DENVs 1-4 em ensaio de ELISA. A performance do ensaio indicou sensibilidade de 88% e especificidade de 91%. As EDIII foram utilizadas também em plataforma de diagnóstico multiplex, e a prova de conceito inicial indicou que elas podem ser aplicadas nessa plataforma de diagnóstico. As &#916NS1 e EDIII DENVs 1-4 foram avaliadas também para diferenciação dos sorotipos. Em análise com amostras de soro de animais infectados observamos maior reatividade da proteína com o soro anti-DENV homólogo, particularmente as proteínas EDIII. Os resultados obtidos com as amostras de soro humano permitiram diferenciar respostas anti-DENV 1 de outros sorotipos com as proteínas EDIII, confirmando a aplicabilidade dessas proteínas para diferenciação de infecção com os diferentes tipos de DENVs. Em conjunto, os resultados obtidos nesse estudo confirmam que os antígenos recombinantes podem ser utilizados como imunobiológicos em testes de diagnóstico da dengue, combinando sensibilidade e especificidade. Os resultados contribuem para a produção de conhecimento científico na área, mas também, abrem perspectivas de desenvolvimento dos novos imunobiológicos para de kits de diagnóstico sorológico para a dengue.