Enzimas calicreína e ciclooxigenase imobilizadas: Estudo de condições para triagem de inibidores

• Autor(a) principal: Carvalho, Daniella Romano de
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-11112021-165644/
• topic: Calicreínas; Ciclooxigenase; Cyclooxygenase; Enzimas imobilizadas; Enzyme inhibitors; Immobilized enzymes; Inibidores enzimáticos; Kallikreins; Ligand screening; Triagem de ligantes

A identificação de compostos que se liguem especificamente a alvos biológicos e que atuem como inibidores enzimáticos tem grande importância nos estudos de desenvolvimento de novos fármacos. Tal paradigma estimula o desenvolvimento de novos métodos de triagem para facilitar e reduzir o tempo de identificação dessas substâncias. Nesse contexto, os biorreatores com enzimas imobilizadas ou IMERs (do inglês immobilized enzyme reactors) têm se destacado como uma alternativa promissora aos ensaios de triagem convencionais. As enzimas calicreínas teciduais (KLKs, do inglês kallikreins) e ciclooxigenases (COXs) humanas desempenham papel importante em diversos processos fisiopatológicos no organismo. A desregulação na expressão e/ou atividade das KLKs, por exemplo, tem sido associada a diversas patologias como doenças de pele, desordens neurológicas e câncer, o que tem despertado considerável interesse na busca de inibidores de KLK. Já as COXs estão envolvidas na biossíntese de prostaglandinas, e são alvos de interesse nos estudos de desenvolvimento de novos fármacos anti-inflamatórios. Considerando a importância desta temática, este trabalho descreve a imobilização covalente da enzima KLK pancreática de porco em matriz de Sepharose-NHS, produzindo os biorreatores KLK-Sepharose-NHS. A enzima KLK imobilizada foi empregada em uma metodologia de ensaio off-line em formato multi-poços com detecção por fluorescência. KLK-Sepharose-NHS apresentou elevada atividade recuperada e manteve a habilidade de reconhecer o substrato sintético Z-Phe-ArgAMC. Foram realizados estudos de inibição utilizando leupeptina como inibidor de referência para determinação da potência inibitória (IC50 = 0,13 ± 0,01 µmol L-1 ) e mecanismo de inibição. Também avaliamos várias matrizes complexas (extratos de plantas e meios microbiológicos) para demonstrar a aplicabilidade de KLKSepharose-NHS. Outra proposta deste trabalho foi o desenvolvimento de ensaio off-line baseado em microcolunas de KLK imobilizada (IMER-KLK-Sepharose-NHS) com detecção por espectrometria de massas. Utilizando tal método foi possível determinar as condições ótimas do ensaio enzimático e os parâmetros cinéticos (KM = 16,3 ± 2,1 µmol L-1 ) para a enzima imobilizada, bem como realizar os estudos de inibição utilizando leupeptina como inibidor de referência (IC50 = 0,89 ± 0,12 µmol L-1 ). De maneira geral, a enzima KLK imobilizada mostrou ótima capacidade de reutilização e foi capaz de reconhecer o inibidor de referência (leupeptina), demostrando que os modelos de ensaio propostos podem ser aplicados na triagem de inibidores. Este trabalho também descreve os esforços para imobilização da enzima COX-2 humana em capilares de sílica fundida e o estudo das condições de uso dos biorreatores em metodologia de ensaio on-line por cromatografia líquida de alta de eficiência e espectrometria de massas.