Seleção in vitro de aptâmeros de RNA como ligantes do receptor purinérgico P2Y2

• Autor(a) principal: Gomes, Katia das Neves
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26112010-090711/
• topic: Ácidos nucléicos; Aptamer; Aptâmero; Nucleic acids; P2Y2; P2Y2; Purinergic receptors; Receptores purinérgicos; SELEX; SELEX

Vários estudos têm apontado a sinalização e os receptores purinérgicos, representados em mamíferos pelos receptores ionotrópicos (P2X1 P2X7) e metabotrópicos (P2Y1,2,4,6, 11,12,14), como um sistema primitivo, envolvido não somente na sinalização neuronal, mas também em muitos outros processos vitais incluindo resposta imune, inflamação, dor, agregação plaquetária e nos processos de diferenciação, proliferação e morte celular, que ocorrem no desenvolvimento e na regeneração tecidual. Condizente com as descrições da literatura, dados do nosso laboratório, baseados na farmacologia dos receptores purinérgicos, sugeriram o envolvimento do subtipo P2Y2 na proliferação e na neurogênese in vitro de células de carcinoma embrionário P19. Tendo em vista a ausência de agonistas e antagonistas específicos para a maioria dos subtipos de receptores purinérgicos, o que vem dificultando a elucidação das funções exatas desses receptores em processos fisiológicos e patológicos, optamos para o screening de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos para a identificação de ligantes de alta afinidade e especificidade para o receptor P2Y2 (procedimento de SELEX, Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Essa abordagem envolve passos reiterativos de seleção in vitro de moléculas de RNA, estabilizadas por substituição do grupo 2´OH das pirimidinas por um átomo de flúor, que possuem afinidade pelo receptor, até que a mistura de RNAs, originalmente de 1013 diferentes seqüências que adotam uma gama de estruturas secundárias e terciárias, esteja purificada para uma população homogênea de ligantes de alta afinidade pelo receptor P2Y2. O processo envolve a transcrição in vitro da biblioteca de DNA para RNA, a apresentação desta ao alvo, a eluição dos ligantes específicos, denominados aptâmeros, e a regeneração da biblioteca de DNA por RT-PCR, a qual, após uma reação de transcrição in vitro, gera a mistura de RNAs para o próximo ciclo de seleção. Neste trabalho, nós utilizamos como alvo o receptor P2Y2 recombinante humano expresso na linhagem de células de astroglioma humano 1321N1. Ao final de nove ciclos de SELEX, nós isolamos 46 sequências que foram agrupadas em três classes estruturais, de acordo com a presença de regiões consensos. A mistura destas moléculas se ligou ao receptor P2Y2 humano com uma constante de dissociação de 164 nM. Um dos clones isolados, o aptâmero B7, se ligou preferencialmente ao receptor P2Y2 (Kd 184 nM), em relação aos receptores P2Y1 e P2Y4 recombinantes expressos em células 1321N1. A interação deste aptâmero não foi dependente da espécie, uma vez que ele foi capaz de se ligar tanto ao receptor P2Y2 de origem humana como murina. A atividade biológica do aptâmero foi avaliada em células P19 (sabidamente expressando receptores P2Y2 endógenos), na qual a proteção do ATP contra a apoptose, provavelmente interagindo com o receptor P2Y2, foi anulada na presença deste aptâmero em uma concentração mil vezes menor do que a do ATP. Além de confirmar a viabilidade da técnica SELEX para identificar ligantes subtipos-específicos dos receptores purinérgicos, o aptâmero anti-P2Y2 serve como ferramenta fundamental para definir demais funções fisiológicas deste receptor. Passos de otimização das suas propriedades como ligante e biodisponibilidade tornarão este aptâmero um composto de alta relevância farmacêutica.