Regulação pré- e pós-transcricional do gene Scratch2 durante a neurogênese no tubo neural posterior.

• Autor(a) principal: Goes, Carolina Purcell
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42134/tde-12022020-153318/
• topic: Cis-elements; Elementos-cis; Gene regulation; miRNA; miRNA; Neurogênese; Neurogenesis; Regulação gênica; Scratch; Scratch

Scratch2 é um fator de transcrição expresso em células recém-egressas do ciclo celular e tem um papel conservado na sobrevivência, diferenciação e migração celular. Scrt2 é expresso em uma população bem restrita de células localizadas na camada interna da zona intermediária do tubo neural em embriões de galinha, e seu padrão de expressão se mantem conservado em vertebrados. Os mecanismos que controlam a sua expressão ainda são desconhecidos e podem contribuir no entendimento sobre regulação gênica durante a diferenciação neural. Aqui, investigamos os mecanismos regulatórios pré- (enhancers e fatores de transcrição) e pós-transcricionais (miRNAs) envolvidos na expressão de cScrt2. Realizamos uma análise in silico e identificamos 1) um potencial elemento-cis conservado (E1), presente tanto em galinha quanto em camundongo, que pode estar envolvido na expressão de Scrt2; 2) Ascl1, Brn2 e Sox2 como fatores de transcrição candidatos a controladores à montante de Scrt2 na cascata gênica, e 3) sítios de ligação para miR-125b, -200b, -429, -211 e -204 na região 3UTR de cScrt2. Testamos a função biológica da região regulatória candidata E1 e da região 3UTR de Scrt2 pela eletroporação no tubo neural embrionário de galinha. A modulação de transcrição modulada por fatores de transcrição via E1 foi testada em ensaio luciferase em células HEK293T. Além disso, realizamos Chromosome Conformation Capture (3C) para verificar interações entre E1 e a região promotora de cScrt2, e utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 para editar E1 e sítios-alvo de miRNAs na 3UTR de cScrt2. Nossos resultados indicam que E1 é m enhancer neural, que dirige a expressão de Scrt2 possivelmente no domínio equatorial do tubo neural. A superexpressão dos fatores de transcrição selecionados, aumentou a expressão de cScrt2 na região dorsal do tubo neural e reduziu o número de subpopulações de células neurais diferenciadas. Além disso, a edição de sítios de miRNA mediada por CRISPR, aumentou a expressão de Scrt2, sugerindo um possível papel de miR-125b e -200b na regulação pós-transcricional de cScrt2. Por fim, propomos que o domino de expressão de cScrt2 seja gerado pela conjunção dos mecanismos de regulação pré- e pós-transcricionais. Neste cenário, E1 modula a transcrição de cSrt2 mediada pelos fatores de transcrição Ascl1 e Brn2. Após a transcrição, os níveis de cScrt2 seriam então delimitados pela ação de miR-125b e -200b na sua 3UTR.