Purificação e caracterização estrutural de um inibidor de serinoprotease isolado de sementes de Cassia leptophylla.

• Autor(a) principal: Alessandro, Fernando
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-09092008-113823/
• topic: Cassia leptophylla; Cassia leptophylla.; estrutura de proteínas; Serinoprotease; serinoprotease; Structural protein

Inibidores de proteases - moléculas capazes de inibir a atividade catalítica de enzimas proteolíticas - compreendem uma das mais abundantes classes de proteínas em plantas. Nas sementes, as funções destas moléculas estão relacionadas com o controle de proteínas endógenas e com mecanismo de defesa contra insetos fitófagos. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar, caracterizar estruturalmente e testar algumas aplicações biotecnológicas de um inibidor de serinoprotease das sementes de Cassia leptophylla. Após extração salina, a partir de cotilédones de sementes secas, o inibidor foi purificado por meio de cromatografia de filtração molecular sobre coluna Superdex75 e cromatografia de troca iônica em uma coluna Mono-Q. A proteína purificada apresentou PI de aproximadamente 4,5 e massa molecular estimado por eletroforese (SDS-PAGE) de 20kDa, sendo constituída por duas cadeias polipeptídicas de l6kDa e 4kDa. A seqüência N-terminal da cadeia de 4kDA (ATEDEKKDLGISIDDCCNRRLVVK) revelou similaridade com outros inibidores de serinoproteases tipo Kunitz isolados de Adenanthera pavonina, Prosopsis juliflora e Acacia confusa; o inibidor em estudo foi denominado CLTI (Cassia 1eptophyZZa trypsin inhibitor). A investigação da seqüência N-terminal da cadeia de 16 kDa, por meio da degradação de Edman automatizada, não deu sinal positivo, indicando provável bloqueio do primeiro resíduo de aminoácido. O espectro de dicroísmo circular (CD) do inibidor revelou que os componentes de estrutura secundária são constituídos predominantemente de folhas-&#946, voltas e estruturas não ordenadas. O espectro de emissão de fluorescência deste inibidor apresentou máximo de emissão em 226 nm, típico de proteínas com os resíduos de triptofano protegidos do solvente. CLTI quando submetido a pHs extremos (ácidos e básicos) revelou alterações de estrutura secundária e foi estável até cerca de 55&#176C (temperatura de transição 59&#176C), ambos investigados por CD e emissão de fluorescência. Ensaios de atividade biológica in vitro revelaram que CLTI inibiu a coagulação de plasma humano citratado, a ação das enzimas tripsina (KI 1,92&#956M), quimotripsina (KI 14,5&#956M), e calicreína plasmática humana (KI 1,5&#956M), mas não apresentou inibição sobre elastase porcina. CLTI formou um complexo estável com a tripsina demonstrado pela eluição do mesmo em coluna de filtração molecular. Este inibidor também mostrou atividade fungicida sobre as cepas de Fusarium monifome e Fusarium gramineanim e atividade fungistática sobre as cepas de Colletotrichum sp. F37 e Colletotrichum sp. P10.