Clonagem, expressão heteróloga e caracterização funcional de peptidase de Fusarium oxysporum em Pichia pastoris

• Autor(a) principal: Cavalcanti, Mariana Antão
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-04062019-141326/
• topic: Fusarium oxysporum; Fusarium oxysporum; Peptidase; Peptidase; Pichia pastoris; Pichia pastoris; Subtilisin; Subtilisina

As peptidases são enzimas da classe das hidrolases que catalisam a quebra de ligações peptídicas de proteínas e peptídeos. Essas enzimas têm elevada relevância em aplicações industriais, sendo bastante utilizadas na produção de detergentes. Muitas enzimas são produzidas através da expressão heteróloga em P. pastoris, sistema de expressão heteróloga com propriedades vantajosas sobre outros sistemas. Diante da importância das enzimas em várias atividades biológicas e de suas possíveis aplicações na indústria, este trabalho teve como objetivo a obtenção de uma peptidase funcional de Fusarium oxysporum através da expressão heteróloga em sistema de P. pastoris. Este estudo realizou a clonagem gênica e produção de uma peptidase de F. oxysporum através de expressão heteróloga em P. pastoris. A peptidase em questão é uma subtilisina, que necessita da clivagem de sua pró-região inibitória para que exerça atividade. Desse modo optou-se por produzir a peptidase em sua forma madura recombinante (pMAD) como forma de obter a enzima funcional. Testou-se a expressão em Pichia pastoris de forma induzida, através do promotor pAOX1 e constitutiva, através do promotor pGAP, sendo que sua produção de forma constitutiva não foi possível. A peptidase produzida foi purificada por cromatografia de afinidade e apresentou atividade funcional evidenciada pela análise do efeito proteolítico. Além disso, a temperatura de 40 oC e o pH 8,0 foram identificados como condições ótimas para atividade enzimática. Diante dos resultados apresentados pode-se dizer que este estudo contribui muito para o conhecimento científico e para a indicação de uma potencial molécula a ser empregada no desenvolvimento de produtos industrializados.