Edição genômica com CRISPR/Cas9 para avaliação do papel da MMP9 e seu regulador o microRNA-21 no câncer de próstata metastático: Estudo in vitro e in vivo

• Autor(a) principal: Camargo, Juliana Alves de
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5153/tde-22092022-123854/
• topic: Apoptose; Apoptosis; CRISPR-Cas systems; Expressão gênica; Gene expression; Matrix metalloproteinase 9; Metaloproteinase 9 da matriz; MicroRNAs; MicroRNAs; Neoplasias da próstata; Prostatic neoplasms; Sistemas CRISPR-Cas

INTRODUÇÂO:O Câncer de Próstata (CaP), possui alta prevalência e representa um importante problema de saúde, com forte impacto econômico se considerarmos o rastreamento, diagnóstico, tratamento e a mortalidade pela doença. Com o avanço da metodologia do CRISPR, novas possibilidades se abriram para o entendimento e controle dos mecanismos de resistência celular. A edição gênica pela técnica de CRISPR-Cas9 é efetiva na correção de mutações celulares que promovem resistência. O microRNA-21, que atua sobre o gene supressor tumoral RECK e o oncogene MMP-9, apresenta um papel importante no processo de migração e invasão das células tumorais para outros tecidos, gerando metástases. Devido à importância destas moléculas na carcinogênese, são necessárias maiores investigações sobre o seu papel no CaP. OBJETIVO:Avaliar o papel da MMP-9 e seu regulador indireto miR-21 no CaP, com a edição gênica pela técnica de CRISPR-Cas9. MÉTODOS: Inicialmente foi feita a inserção das sequências de RNAs guia (sgRNA) da MMP9 e miR-21 no plasmídeo PX-330. Em seguida, os plasmídeos com os insertos para MMP-9 foram transfectados em linhagens celulares de CaP DU145 e PC-3M-luc-C6. Foi feita a análise da expressão gênica e proteica da MMP9 por qPCR e Western Blotting, e a imunofluorescência. Os genes alvo do miR-21, incluindo RECK, MARKS, BTG2, PDCD4, as integrinas ITGB1 e ITGB3, CDH1, BAX e mTOR, foram avaliados por qPCR. Foi feita a citometria de fluxo para validar a expressão proteica relacionada à apoptose e proliferação celular, em células editadas para MMP9 e miR-21, utilizando os marcadores Annexin5 e 7-AAD, eKi67 respectivamente. Foi feito o ensaio de invasão com matrigel, e as células foram analisadas 48 horas após, com microscopia ótica. O grupo controle consistiu em células transfectadas com plasmídeo PX-330 sem as inserções de sgRNA(Scramble). O crescimento tumoral foi avaliado por um sistema de bioluminescência in vivo, após a injeção de 300 mil células, divididas em grupos, Scramble, editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 em camundongos Balb/c Nude. Esses animais foram acompanhados por 14 dias.RESULTADOS: Foi realizada a padronização das técnicas de digestão e inserção dos sgRNAs da MMP9 e miR-21 no plasmídeo PX-330, validadas por sequenciamento. Após essa etapa, observamos que as linhagens celulares transfectadas com o plasmídeo com sgRNA1 e 2 para MMP9 apresentaram GFP positivo, o que mostra a eficácia da transfecção. As células editadas para miR-21 com CRISPR-Cas9 apresentaram expressão gênica de RECK, MARKS, BTG2, e PDCD4 aumentadas em relação ao grupo Scramble. CDH1 e integrinas ITGB3 e ITGB1 foram aumentadas em células editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 quando comparado ao Scramble.O aumento do BAX e a diminuição da expressão de mTOR foram observados nas células editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 comparação ao grupo Scramble. Estes resultados foram validados por citometria de fluxo, mostrando a redução da proliferação e aumento da apoptose em células editadas para MMP9 e miR-21 com CRISPR-Cas9 quando comparados ao Scramble. No ensaio de invasão celular, observamos que as células editadas para MMP9 e miR-21 apresentam taxas de invasão inferiores às do grupo Scramble. Nos experimentos in vivo, o crescimento tumoral foi significativamente reduzido nos animais que receberam células editadas com CRISPR-Cas9 para MMP9, quando comparadas ao Scramble. Não encontramos diferença nos animais que receberam células editadas para miR-21. CONCLUSÃO: A edição gênica por CRISPR-Cas9 de MMP9 e miR-21 em linhagens celulares de CaP metastáticas modula fatores moleculares que atenuam a proliferação e invasão celular e estimulam a apoptose, possivelmente impedindo a evolução do tumor