Produção biotecnológica de L-asparaginase (ASP1) de Saccharomyces cerevisiae em sistema de expressão heterólogo Pichia pastoris

• Autor(a) principal: Divino, Bruna de Souza
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-15122015-172127/
• topic: Enzimas; Enzymes; Expressão; Expression; L- Asparaginase; L-asparaginase; Pichia pastoris; Pichia pastoris; S. cerevisiae; S. cerevisiae

Utilizada amplamente no tratamento de Leucemias Linfoblásticas Agudas, a L-Asparaginase é uma enzima que atua diminuindo a concentração de L-asparagina livre no plasma e, dessa forma, impede a proliferação de células cancerígenas. Isso ocorre porque tais células, ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar o aminoácido L-asparagina que necessitam para a síntese proteica por não possuírem a enzima asparagina sintetase devido a um silenciamento genético. A L-Asparaginase utilizada no Brasil era importada e produzida em bactéria, o que gerava problemas com custo e abastecimento, além de causar algumas reações imunológicas aos usuários. Isso impulsiona a encontrar alternativas para produção nacional de tal enzima e, se possível, com menor potencial alergênico. Para isso, foi estudada a produção da enzima L-Asparaginase do gene ASP1 de Saccharomyces cerevisiae em sistema de expressão heteróloga Pichia pastoris através da clonagem do gene sintético (ASP1), com códons otimizados para expressão em P. pastoris, estudo este nunca antes realizado ao que se sabe. Além disso, a produção da enzima foi realizada com auxílio de um planejamento experimental fatorial em agitador orbital levando em conta as variáveis: pH, temperatura e concentração do indutor. A melhor condição encontrada dentre as estudadas neste trabalho foi, a temperatura de 20°C, pH 6,0 e concentração de indutor de 1,5% que alcançou uma atividade de 6,9 U/g de célula e apesar do esforços, o peptídeo sinal utilizado (alfa da S. cerevisiae) não foi capaz de promover a secreção da enzima para o meio extracelular.Deve-se salientar que a realização de um maior número de ensaios através de um planejamento experimental fatorial fracionário para encontrar uma região de rendimentos máximos talvez melhore o ajuste dos modelos mostrados. Este trabalho foi a primeira tentativa de expressão do gene ASP1 de S. cerevisiae em Pichia pastoris até o momento, e pretende-se aprofundar mais este estudo.