Obtenção das quinases dependentes de ciclinas CDK9 e CDK11 humanas utilizando um sistema bacteriano de expressão (E. coli)

• Autor(a) principal: Santos, Níkolas Paparidis Ferreira dos
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-16062015-091524/
• topic: Escherichia coli; CDK11; CDK11; CDK9; CDK9; expressão heteróloga, Escherichia coli; heterologous expression

As CDKs 9 e 11 fazem parte da subfamília de CDKs transcricionais, e portanto desempenham papéis de controle na dinâmica atividade de síntese e processamento do RNA mensageiro pela RNA Polimerase II. Devido à sua capacidade de modular individualmente a atividade dos complexos de transcrição da RNAP II, estas quinases assumem uma grande importância para a regulação da expressão gênica em células eucarióticas. Casos de desregulação da atividade de CDKs transcricionais têm sido frequentemente relacionados a diversas patologias humanas graves, incluindo vários tipos de câncer e também a AIDS (em razão do papel essencial desempenhado pela CDK9 na replicação do HIV. O objetivo deste trabalho é a obtenção das CDKs humanas 9 e 11 através da expressão heteróloga em Escherichia coli, buscando o aperfeiçoamento de métodos para produzir estas enzimas em quantidade e pureza suficientes para aplicação em estudos estruturais. A utilização de um sistema bacteriano oferece muitas vantagens práticas, como a simplicidade da técnica, baixo custo, altos níveis de expressão, e elevado rendimento na purificação do produto. No entanto, a obtenção de quinases humanas ativas a partir de E. coli sempre representou um desafio experimental, devido aos problemas comumente associados à expressão heteróloga. Os resultados apresentados aqui demonstram a possibilidade de se obter a CDK9 humana enzimaticamente ativa pelo reenovelamento in vitro da proteína expressa pela bactéria na forma de corpos de inclusão, após etapas de solubilização e purificação em condições desnaturantes. Por outro lado, a CDK11 humana só pôde ser obtida em uma versão encurtada, consistindo apenas no seu domínio quinase, devido à forte inibição que um trecho N-terminal da sequência mostrou exercer sobre a expressão da proteína. Assim, este trabalho fornece exemplos de como é possível superar algumas das adversidades comuns da expressão heteróloga a fim de se obter CDKs humanas ativas empregando o sistema bacteriano.