Clonagem, expressão, purificação e caracterização biofísica da proteína quinase dependente de ciclina 11 obtida pela expressão em Escherichia coli

• Autor(a) principal: Pepino, Rebeka de Oliveira
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-25112021-092117/
• topic: biophysical assays; CDK11; CDK11; clonagem; cloning; ensaios biofísicos; Escherichia coli; Escherichia coli; expressão; expression; roscovitina; roscovitine

A superexpressão e hiperativação da CDK11 desempenham papéis importantes no crescimento e proliferação de vários tipos de câncer. O silenciamento da CDK11 é capaz de inibir a proliferação celular e induzir a apoptose em células de câncer de mama, mieloma múltiplo, osteossarcoma e lipossarcoma. Nesse cenário, a CDK11 tornou-se um alvo terapêutico promissor; no entanto, faltam informações estruturais para o desenvolvimento de inibidores de CDK11, uma vez que esta proteína não tem estrutura cristalográfica resolvida até o momento. O domínio quinase de CDK11 (CDK11Δ) selecionado a partir de corpos de inclusão foi redobrado e purificado usando cromatografia de afinidade ao níquel. O rendimento final de CDK11Δ foi de 30 mg / L de meio de cultura, com alta pureza. A proteína foi analisada por espectroscopia de dicroísmo circular e espectrofluorimetria. A análise de espectros de dicroísmo circular estimou 31% de hélices α , temperatura de desnaturação de 62 oC e estabilidade de armazenamento por até 70 dias a 4 oC. A espectrofluorimetria confirmou a interação da proteína com seu ligante natural ATP, e também com a roscovitina, um conhecido inibidor de outras CDKs; os valores de Kd medidos foram 4 µM e 16 nM, para ATP e roscovitina, respectivamente, o que indica o segundo como um potencial inibidor de CDK11. Na análise bioinformática, os modelos construídos para o complexo CDK11Δ-ATP indicam que Lys134, Lys37, Thr18 e Asn137 são resíduos determinantes na formação de ligações de hidrogênio com ATP, e para o complexo CDK11Δ-roscovitina, as ligações de hidrogênio envolvem a cadeia principal de resíduos Val89 e Glu90. O número de contatos Van Der Walls encontrados na CDK11 são semelhantes ao valor encontrado para a CDK2, sugerindo que a CDK11, assim como a CDK2, tem o potencial de ser inibida pela roscovitina. O estudo das interações com esses ligantes contribuirá para o desenvolvimento de futuros inibidores promissores para CDK11. Os valores das constantes de dissociação (Kd) para CDK11 com os inibidores 3a, 3b e 3f, foram de 409 µM, 35 µM e de 5 µM, respectivamente, indicando interações fraca (3a) e moderadas (3b e 3f).