Caracterização da DEAD-box RNA helicase cc1478 em Caulobacter crescentus e sua regulação.
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2018 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP |
Texto Completo: | https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-07122021-095826/ |
Resumo: | As helicases de RNA da família DEAD-box (DEAD-box RNA helicases) são enzimas envolvidas em diversos processos biológicos importantes, como a degradação e estabilização de ácidos nucléicos, montagem de complexos riboprotéicos, e biogênese do ribossomo. Caulobacter crescentus é uma bactéria oligotrófica pertencente ao grupo das α-proteobactérias, que possui três genes codificando RNA helicases da família DEAD-box. Resultados anteriores sugerem que uma destas enzimas, DbpA, codificada pelo gene CC1478, é uma RNA helicase funcional, mas possui uma extremidade carboxi-terminal pouco conservada, com possível função de ancoragem ao ribossomo. Este projeto propõe caracterizar a RNA helicase DbpA, definindo sua regulação, avaliar as informações filogenéticas para determinar sua origem evolutiva, e determinar a importância deste domínio C-terminal para a função da enzima. A expressão da proteína na resposta a estresses, e sua interação com complexos proteicos como o ribossomo também foram avaliados. Almejando caracterizar a função e regulação do gene CC1478, foi obtida uma linhagem onde a proteína continha uma etiqueta no amino-terminal. A expressão, a nível transcricional foi medida através da técnica de qRT-PCR, e a nível traducional por Western blotting onde observou-se pouca diferença entre os níveis da proteína nos vários estresses. Resultados obtidos com as construções truncadas no C-terminal indicam que a proteína sem a extensão C-terminal perde parte de sua função em relação à selvagem, e que o domínio DbpA é importante para a sua função. A análise da interação com as subunidades ribossomais mostrou que a proteína estava presente nas frações contendo subunidades do ribossomo tanto quanto ribossomos completos. Filogeneticamente a cauda C-terminal se mostra como uma região hiper-variável, rica em aminoácidos carregados, porém não sempre na mesma quantidade. No aspecto evolutivo esta família de proteínas se mostra rica em parálogos, sendo que muitos deles ainda são complementares na sua função. O clã RRM (RNA-recognitiion-motif), no qual DbpA está incluída, possui uma origem tão basal quanto LUCA, o que sugere que estas proteínas sempre estiveram atuando na montagem no ribossomo, e em redundância, conferindo versatilidade frente aos estresses do meio. |
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Caracterização da DEAD-box RNA helicase cc1478 em Caulobacter crescentus e sua regulação.Characterization of the DEAD-box RNA helicase CC1478 in Caulobacter crescentus and its regulation.Caulobacter crescentusCaulobacter crescentusChoque-frioCold-shockHelicase de RNARNA helicaseAs helicases de RNA da família DEAD-box (DEAD-box RNA helicases) são enzimas envolvidas em diversos processos biológicos importantes, como a degradação e estabilização de ácidos nucléicos, montagem de complexos riboprotéicos, e biogênese do ribossomo. Caulobacter crescentus é uma bactéria oligotrófica pertencente ao grupo das α-proteobactérias, que possui três genes codificando RNA helicases da família DEAD-box. Resultados anteriores sugerem que uma destas enzimas, DbpA, codificada pelo gene CC1478, é uma RNA helicase funcional, mas possui uma extremidade carboxi-terminal pouco conservada, com possível função de ancoragem ao ribossomo. Este projeto propõe caracterizar a RNA helicase DbpA, definindo sua regulação, avaliar as informações filogenéticas para determinar sua origem evolutiva, e determinar a importância deste domínio C-terminal para a função da enzima. A expressão da proteína na resposta a estresses, e sua interação com complexos proteicos como o ribossomo também foram avaliados. Almejando caracterizar a função e regulação do gene CC1478, foi obtida uma linhagem onde a proteína continha uma etiqueta no amino-terminal. A expressão, a nível transcricional foi medida através da técnica de qRT-PCR, e a nível traducional por Western blotting onde observou-se pouca diferença entre os níveis da proteína nos vários estresses. Resultados obtidos com as construções truncadas no C-terminal indicam que a proteína sem a extensão C-terminal perde parte de sua função em relação à selvagem, e que o domínio DbpA é importante para a sua função. A análise da interação com as subunidades ribossomais mostrou que a proteína estava presente nas frações contendo subunidades do ribossomo tanto quanto ribossomos completos. Filogeneticamente a cauda C-terminal se mostra como uma região hiper-variável, rica em aminoácidos carregados, porém não sempre na mesma quantidade. No aspecto evolutivo esta família de proteínas se mostra rica em parálogos, sendo que muitos deles ainda são complementares na sua função. O clã RRM (RNA-recognitiion-motif), no qual DbpA está incluída, possui uma origem tão basal quanto LUCA, o que sugere que estas proteínas sempre estiveram atuando na montagem no ribossomo, e em redundância, conferindo versatilidade frente aos estresses do meio.DEAD-box RNA helicases (DEAD-box RNA helicases) are enzymes involved in several important biological processes, such as the degradation and stabilization of nucleic acids, assembly of riboprotein complexes, and biogenesis of the ribosome. Caulobacter crescentus is an oligotrophic bacterium belonging to the α-proteobacteria group, which has three genes encoding RNA helicases of the DEAD-box family. Previous results suggest that one of these enzymes, DbpA, encoded by the CC1478 gene, is a functional helicase RNA, but has a poorly conserved carboxy-terminal end, with possible ribosome anchoring function. This project aims to characterize the regulation of DbpA, defining its regulation, to evaluate the phylogenetic information to determine its evolutionary origin, and to determine the importance of this C-terminal domain for the function of the enzyme. Protein expression in response to stress, and its interaction with protein complexes, such as the ribosome, were also evaluated. In order to characterize the function and regulation of the CC1478 gene, a strain was obtained where the protein contained an amino-terminal tag. Expression at the transcriptional level was measured by qRT-PCR and at the translational level by Western blotting, and little difference was observed for protein levels in the various stresses. Results obtained with the truncated constructs of the C-terminus indicate that the protein lacking the C-terminal extension loses part of its function compared to the wild type, and that the DbpA domain is important for its function. Analysis of the interaction with the ribosomal subunits showed that the protein was present in the ribosome subunits as well as in complete ribosomes fractions. Phylogenetically the C-terminal tail is a hyper-variable region, rich in charged amino acids, but not always in the same amount. In the evolutionary aspect this family of proteins is rich in paralogues, and many are still complementary in their function. The RRM (RNA-recognitiion-motif) clan, in which DbpA is included, has an origin as basal as LUCA, suggesting that these proteins have always been acting in the assembly in the ribosome, and in redundancy, providing versatility in face of the environmental stresses.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPMarques, Marilis do ValleRibeiro, Rodolfo Alvarenga2018-12-05info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-07122021-095826/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPLiberar o conteúdo para acesso público.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2023-12-08T13:00:21Zoai:teses.usp.br:tde-07122021-095826Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212023-12-08T13:00:21Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false |
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As helicases de RNA da família DEAD-box (DEAD-box RNA helicases) são enzimas envolvidas em diversos processos biológicos importantes, como a degradação e estabilização de ácidos nucléicos, montagem de complexos riboprotéicos, e biogênese do ribossomo. Caulobacter crescentus é uma bactéria oligotrófica pertencente ao grupo das α-proteobactérias, que possui três genes codificando RNA helicases da família DEAD-box. Resultados anteriores sugerem que uma destas enzimas, DbpA, codificada pelo gene CC1478, é uma RNA helicase funcional, mas possui uma extremidade carboxi-terminal pouco conservada, com possível função de ancoragem ao ribossomo. Este projeto propõe caracterizar a RNA helicase DbpA, definindo sua regulação, avaliar as informações filogenéticas para determinar sua origem evolutiva, e determinar a importância deste domínio C-terminal para a função da enzima. A expressão da proteína na resposta a estresses, e sua interação com complexos proteicos como o ribossomo também foram avaliados. Almejando caracterizar a função e regulação do gene CC1478, foi obtida uma linhagem onde a proteína continha uma etiqueta no amino-terminal. A expressão, a nível transcricional foi medida através da técnica de qRT-PCR, e a nível traducional por Western blotting onde observou-se pouca diferença entre os níveis da proteína nos vários estresses. Resultados obtidos com as construções truncadas no C-terminal indicam que a proteína sem a extensão C-terminal perde parte de sua função em relação à selvagem, e que o domínio DbpA é importante para a sua função. A análise da interação com as subunidades ribossomais mostrou que a proteína estava presente nas frações contendo subunidades do ribossomo tanto quanto ribossomos completos. Filogeneticamente a cauda C-terminal se mostra como uma região hiper-variável, rica em aminoácidos carregados, porém não sempre na mesma quantidade. No aspecto evolutivo esta família de proteínas se mostra rica em parálogos, sendo que muitos deles ainda são complementares na sua função. O clã RRM (RNA-recognitiion-motif), no qual DbpA está incluída, possui uma origem tão basal quanto LUCA, o que sugere que estas proteínas sempre estiveram atuando na montagem no ribossomo, e em redundância, conferindo versatilidade frente aos estresses do meio. |
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