Estudo do papel das RNA helicases da família DEAD-box RhlB e RhlE na estabilidade de RNAs e na expressão gênica em Caulobacter crescentus

• Autor(a) principal: Araujo, Hugo Libonati de
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-13062023-115123/
• topic: Genética microbiana; Caulobacter crescentus; Caulobacter crescentus, Microbial genetics; Biologia molecular; Choque-frio; Coldshock; Molecular biology; RNA helicase; RNA helicase

Caulobacter crescentus é uma alfaproteobactéria ambiental que apresenta um ciclo celular complexo, o que a torna um excelente modelo para o estudo de regulação gênica neste grupo. O estresse térmico causado por quedas de temperaturas gera uma resposta adaptativa conhecida como Reposta ao Choque-Frio, caracterizada por alterações em diversos componentes celulares e vias metabólicas. Uma dessas alterações é a tendência das moléculas de RNA de formarem estruturas secundárias estáveis, dificultando sua tradução e degradação. As RNA helicases da família DEAD-box são proteínas com a capacidade de remodelar estruturas de RNA e complexos de RNA-proteína. O objetivo deste trabalho foi definir os papéis fisiológicos das RNA helicases DEAD-box RhlB e RhlE em C. crescentus, particularmente em baixa temperatura, bem como investigar a interação de RhlB com o degradossomo de RNA. Ensaios de crescimento em baixa temperatura e na recuperação do congelamento foram realizados, bem como a identificação dos genes diferencialmente expressos no choque-frio e nas linhagens mutantes rhlB e rhlE sob diferentes temperaturas de crescimento. Foi avaliada também a interação de RhlE com o ribossomo, e linhagens contendo FLAG-RhlB com diferentes extensões da região C-terminal foram utilizadas para determinar os seus RNAs ligantes e para o mapeamento dos sítios de interação com o degradossomo. Os resultados de sequenciamento de RNA nos permitiram caracterizar a resposta de C. crescentus ao choque-frio, mostrando importantes alterações em vias do metabolismo de ferro, sistemas de transporte e detoxificação e homeostase de cátions. Foi observado que RhlE e Rho parecem participar da regulação do operon kdp em baixa temperatura por meio de estabilização do mensageiro e/ou por uma possível atenuação de transcrição. Apesar de não conseguir concluir o efeito de RhlE sobre a expressão gênica de C. crescentus, a análise do transcritoma do mutante rhlE indicou a manutenção da resposta ao frio observada na linhagem selvagem, e os experimentos de associação com o ribossomo mostraram dados inconclusivos. O mutante rhlB apresentou uma menor expressão na maioria dos genes identificados pelo sequenciamento, com um aumento considerável do número de genes após o choque-frio. Dentre estes, as principais categorias afetadas foram de transporte e metabolismo de ions inorgânicos, tradução, estrutura e biogênese ribossomal, e modificações pós-traducionais. Também foi observada uma queda considerável da viabilidade na recuperação do congelamento após incubação no frio no mutante rhlB, provavelmente por um defeito na montagem de uma resposta crioprotetora eficiente. A deleção da região C-terminal completa de RhlB gera um fenótipo de recuperação do congelamento pior que uma deleção parcial, indicando uma falta de interação com a RNase E e/ou uma possível redução da sua atividade de helicase.