Análise genética dos pigmentos visuais da Tartaruga-de-Orelha-Vermelha,Trachemys scriptaelegans (Testudine, Emydidae)

• Autor(a) principal: Corredor, Vitor Henrique
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/47/47135/tde-08022021-152740/
• topic: 11-cis-3; 11-cis-3; 11-cis-retinal; 11-cis-retinal; 4-dehidroretinal; 4-dehidroretinal; fotorreceptores; Fotorreceptores; Opsinas; Opsinas; Retina; Retina; Trachemys scripta elegans; Trachemys scripta elegans

O sistema visual dos vertebrados é responsável pela captura e processamento das informações luminosas do ambiente, processo que se inicia na retina a partir da absorção de um quantum de luz pelos pigmentos visuais, localizados no segmento externo dos fotorreceptores, cones e bastonetes. Os pigmentos visuais são proteínas de membrana da família dos receptores acoplados à proteína G, opsinas e rodopsinas, ligados a uma molécula fotossensível derivada da vitamina A1, retinal, e em algumas espécies, o 3,4-dehidroretinal, derivado da vitamina A2. A interação do cromóforo com resíduos de aminoácidos específicos determina a banda de absorção espectral e respectivo comprimento de onda máximo (max) do pigmento visual. Adicionalmente, a troca do cromóforo retinal pelo 3,4-dehidroretinal, ocasiona o deslocamento batocrômico do max. A tartaruga-de-orelha-vermelha, Trachemys scripta elegans, utiliza o 3,4-dehidroretinal e expressa as cinco classes de opsinas de vertebrados, a rodopsina, RH1, em bastonetes, com max em 518 nm, e quatro opsinas expressas em diferentes cones, SWS1 (max 372 nm), SWS2 (max 458 nm), RH2 (max 518 nm) e LWS (max 617 nm). Este estudo teve como objetivo sequenciar os cinco genes de opsinas visuais expressos na retina de T. s. elegans e predizer o max das opsinas com base na sequência de aminoácidos e em modelos computacionais. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa com Animais do Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo (Protocolo 5446131117). Um indivíduo adulto foi eutanasiado com tiopental sódico (100 mg/ kg), os olhos foram enucleados e preservados em RNA later a 4º C. O RNA total foi extraído a partir das retinas homogeneizadas, e convertido em DNA complementar (cDNA). Os genes de opsinas foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando primers específicos. Os produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose (1%), purificados e sequenciados por sequenciamento Sanger. A identidade de cada gene foi confirmada com uso da ferramenta BLASTn e a partir de análises filogenéticas. O max de cada pigmento visual foi estimado a partir dos aminoácidos presentes em posições importantes para o deslocamento espectral descritos na literatura. Estes valores de max foram corrigidos considerando o deslocamento causado pelo uso do cromóforo 3,4-dehidroretinal, com base em curvas de calibração desenvolvidas a partir de valores de max medidos em opsinas com ambos os tipos de cromóforos. Para todos os fotopigmentos a estimativa do max foi próxima dos valores descritos em estudos prévios: SWS1 = 374 nm, SWS2 = 456 nm, RH1 = 518 nm, RH2 = 519 nm, e LWS = 617 nm. Os modelos computacionais foram elaborados a partir da técnica de modelagem comparativa (MC) e modelagem por threading. O espectro de absorção foi analisado com o auxílio do software ORCA segundo o método TD-DFT, aplicando-se a base de cálculo funcional B3LYP e 6-31G. Todos os modelos apresentaram boa qualidade estrutural, com mais de 90% dos aminoácidos dispostos em regiões altamente favoráveis, de acordo com o diagrama de Ramachandran. Para cada modelo, foram realizados estudos de docagem molecular para verificar o melhor posicionamento da estrutura do cromóforo na proteína. O max estimado com base nos modelos computacionais foram coerentes com o max da rodopsina, 517 nm, porém apresentou diferenças em relação às opsinas de cones: SWS1 = 400 nm, SWS2 = 437 nm, RH2 = 500 nm, e LWS = 627 nm. Estas diferenças podem ser resultantes da abordagem computacional utilizada, em que apenas aminoácidos distantes até 4 angströms do cromóforo foram considerados. Este trabalho estabeleceu uma equação capaz de determinar o max de pigmentos visuais baseados no uso da vitamina A2, e mostrou que as estimativas de max baseadas nos aminoácidos nos resíduos de deslocamento espectral das cinco opsinas foram coerentes com registros de microespectrofotometria e eletrofisiologia. Embora as estimativas de max obtidas a partir dos modelos computacionais tenham apresentado inconsistências, as análises in silico foram promissoras e possibilitam a aplicação de uma nova abordagem metodológica para investigações futuras da sensibilidade espectral de vertebrados