Clonagem, expressão heteróloga e caracterização do gene Smp_158240 de Schistosoma mansoni

• Autor(a) principal: Souza, Aline Kusumota Luiz de
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60136/tde-06122013-161247/
• topic: Biochemical characterization; Biophysical characterization; Caracterização bioquímica; Caracterização estrutural; Clonagem; Cloning; Expressão; Expression; Fumarate hydratase; Fumarato hidratase; Purificação; Purification; Schistosoma mansoni; Schistosoma mansoni

Segundo dados recentes da Organização Mundial de Saúde, as doenças parasitárias afetam um sexto da população mundial, totalizando de mais de um bilhão de pessoas. A esquistossomose, em particular, é uma doença parasitária negligenciada pela saúde pública, causada pelo parasita helminto trematódeo do gênero Schistosoma, e que afeta mais de 230 milhões de indivíduos em todo o mundo, 6 milhões no Brasil, causando risco a aproximadamente 700 milhões de pessoas. Na busca por novas ferramentas para o combate à esquistossomose, uma importante estratégia consiste na identificação e caracterização de alvos moleculares do parasita Schistosoma. As fumarato hidratases são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e têm sido consideradas potenciais alvos macromoleculares para o planejamento de novos fármacos antiparasitários. Dentro desse contexto, o presente trabalho visou a clonagem, expressão, purificação e caracterização estrutural e bioquímica do produto do gene Smp_158240, predito como codificador da enzima fumarato hidratase para o parasita Schistosoma mansoni. O gene Smp_158240 foi sintetizado quimicamente com otimização de códons para expressão em E. coli e clonado nos vetores de expressão pET28a e pET28sumo. O produto do gene, denominado SmFH foi expresso em bactéria E. coli BL21(DE3) e purificado com excelente rendimento e grau de pureza. Estudos de espalhamento dinâmico de luz, associados à cromatografia por filtração em gel indicam que a proteína SmFH se oligomeriza na forma de um tetrâmero, e estudos por dicroísmo circular foram utilizados para estimar o conteúdo de estrutura secundária em 60,8 % de α-hélices, 5,7 % de fita-β e 37,6 % de coil-turn. Apesar dos resultados indicarem que a SmFH se oligomeriza e se enovela como previamente reportado para as enzimas fumarato hidratase da classe II, os ensaios de atividade indicaram que o produto do gene Smp_158240 apresenta baixa atividade fumarásica e se mostra instável para a realização dos experimentos de cristalização. A realização de predição de estrutura por modelagem molecular por homologia identificou regiões de grandes diferenças entre o modelo gerado para SmFH e as estruturas descritas para outras enzimas da mesma classe. Em particular, uma dessas variações consiste na inserção de 7 resíduos em uma região altamente conservada do sítio ativo (SS-loop), alterando significativamente a conformação e dinâmica da proteína e fornecendo assim as bases estruturais para justificar a falta de atividade observada para o produto codificado pelo gene Smp_158240. Uma análise estrutural cuidadosa do modelo predito para SmFH, associado à análise do padrão da estrutura primária encontrado para enzimas da mesma classe sugere um erro na sequência do gene depositada no banco de dados e permite propormos a correta sequência para o gene que codifica a enzima fumarato hidratase em Schistosoma mansoni.