Enterococcus faecalis em infecções endodônticas primárias: prevalência, fatores de virulência e suscetibilidade aos procedimentos endodônticos

• Autor(a) principal: Fernandes, Fernanda Silva
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/25/25147/tde-20112019-203848/
• topic: Anaerobiosis; Biofilm; Biofilmes; Biologia molecular; Confocal microscopy; Endodontia; Endodontics; Microbiology; PCR real-time; Real-time PCR; Virulence factors

O presente estudo teve como objetivo investigar a presença e a expressão de genes de virulência (ace, asa esp) de 5 cepas isoladas de canais radiculares com infecção primária, cultivados em formas planctônicas ou em biofilme, comparando os isolados clínicos com a cepa ATCC 29212 (1o experimento). Também avaliar a quantidade e a atividade metabólica de bactérias em canais radiculares com infecção primária utilizando métodos moleculares baseados na detecção de rDNA e rRNA durante o tratamento endodôntico (2o experimento). No 1o experimento, o isolamento das cepas foi realizado por série bioquímica e a identificação dos genes foi realizada através de reação de PCR convencional. Foram constituídos biofilmes mensurados quanto ao volume por microscopia confocal de varredura a laser (MCVL) e comparados com a expressão gênica por meio de extração de RNA, transcrição em cDNA e PCR em tempo real (qPCR) das cepas cultivadas em biofilme ou na forma planctonica. No 2o experimento, amostras microbiológicas de 22 canais radiculares foram coletadas após a abertura coronária (S1), após o preparo biomecânico (S2) e após medicação intracanal por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). DNA e cDNA foram submetidos a reações de qPCR utilizando iniciadores complementares à sequência de 16S rRNA de E. faecalis. O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA. A atividade metabólica bacteriana foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. A cepa 25.1 produziu o biofilme menos denso, sendo diferente estatisticamente das demais cepas, coincidindo com a ausência de dois genes de adesão. A cepa 37, seguida da 2.5 produziram biofilmes mais densos. A expressão dos genes ace e asa não foi diferente nas formas planctônicas ou de biofilme. No entanto, o gene esp foi mais expresso quando as bactérias estavam em forma de biofilme. E. faecalis foi detectado em 10% (3/30) e 43,4% (13/30) das amostras S1 utilizando qPCR baseado em rDNA e rRNA, respectivamente. Nas amostras S2 e S3 em 3,4% (1/30) das amostras pelo método baseado em rDNA e em 20% (6/30) pelo método baseado em rRNA. A taxa de detecção de E. faecalis foi maior pelo método baseado em rRNA quando comparado ao de rDNA nas amostras iniciais (S1). Na comparação entre as amostras, não houve redução significativa do número de cópias de rDNA entre S1 e S2 (P = 0,10), S2 e S3 (P = 0,65) e S1 e S3 (P = 0,15). Da mesma forma, os níveis de rRNA não sofreram mudanças significativas em S2 (P = 0,25) quando comparados às amostras S1, nem em S3 (P = 0,46) quando comparados às amostras S2. Baseados nesses achados, concluiu-se que existem variações na presença de fatores de adesão/coagregação nas cepas da mesma espécie, podendo estar relacionados entre si para maior virulência. Dos genes estudados, o esp parece estar relacionado com maior biovolume de biofilme, uma vez que sua expressão aumenta nesta condição. Concluiu-se também que o ensaio de qPCR baseado em rRNA revelou uma alta prevalência de E. faecalis nas infecções endodônticas primárias e que este permaneceu metabolicamente ativo nos canais radiculares após o preparo biomecânico e medicação intracanal.