Avaliação do efeito sinérgico da LPMO AfAA9_B de Aspergillus fumigatus nos processos de hidrólise de material lignocelulósico

• Autor(a) principal: Gerolamo, Luis Eduardo
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-03102023-084623/
• topic: Aspergillus fumigatus; Aspergillus fumigatus; Clonagem e caracterização bioquímica; Cloning and biochemical characterization; Ensaios de hidrólise com coquetel de celulases; Hydrolysis assays with cellulase cocktail; Lignocellulosic materials; LPMO; LPMO; Materiais lignocelulósicos

Desde o advento da revolução industrial o consumo de energia global aumentou exponencialmente, tendo como principal matriz os combustíveis fósseis. Como consequência, atualmente o mundo enfrenta não somente escassez de energia como também problemas com a poluição gerada com a queima desses materiais. Nesse cenário, materiais como a biomassa lignocelulósica, até então vistos como resíduos, ganham destaque. Esses materiais formados por 3 componentes principais (32-55% celulose; 19-32% hemicelulose; e 19-32% lignina), devido aos seus polissacarídeos constituintes são ricos em energia e se apresentam como uma possível alternativa sustentável para a geração de energia e produção de combustíveis, como por exemplo, o etanol de segunda geração (2G) obtido a partir do bagaço de cana-de-açúcar. Contudo, tais materiais são altamente recalcitrantes e necessitam de tratamentos prévios para que os polissacarídeos se tornem disponíveis e sejam quebrados em unidades de açúcares simples para posterior fermentação. Nesse sentido, as Glicosil Hidrolases (GHs) juntamente com as Monooxigenases Líticas de Polissacarídeos (LPMOs) destacam-se como uma das principais enzimas atuantes na quebra dos mesmos. As LPMOs são enzimas da classe AA (Atividade Auxiliar) com mecanismos de ação oxidorredutivos que atuam nos carbonos C1 e/ou C4 das ligações glicosídicas de açúcares complexos como a celulose e quitina e que podem intensificar a ação de outras celulases canônicas. A fim de contribuir com o estudo de novas enzimas, nesse trabalho caracterizamos o novo gene AFUA_4G07850 codificante da AfAA9_B, uma LPMO de Aspergillus fumigatus secretada quando crescido na presença de bagaço de cana explodido (SEB). O alinhamento da sequência com as demais LPMOs descritas na literatura, permitiu a identificação dos resíduos His1, His86 e Tyr175 conservados como constituintes da braçadeira de histidina, estrutura catalítica característica desse tipo de enzima. Análises das estruturas secundárias e terciárias realizadas via dicroísmo circular (CD) e emissão de fluorescência intrínseca de triptofano (ITFE), respectivamente, demonstraram a presença de 8,3% de alfa hélices, 31,4% de folhas beta, 11,9% de alças e 48,4% de estruturas desordenadas e que seus resíduos de Trp tornam-se mais expostos ao meio aquoso com o aumento da temperatura. Além disso, o valor da temperatura de transição da enzima (Tm) do estado nativo para o desnaturado foi de 55,22 °C via CD e 53,60 °C via ITFE. A caracterização da atividade da enzima demonstrou que a enzima atua melhor em pH=9, sendo capaz de manter 100% de sua atividade mesmo após incubações de 24 a 72 horas na faixa de pH de 3 a 10. A enzima também é capaz de manter aproximadamente 70% de sua atividade após 72 horas a 50°C e mais de 50% após 48 horas a 60°C. As constantes cinéticas (usando 2,6-DMP como substrato) apresentaram valores de KM = 0,79 µM e Vmax = 1481 U/g quando em pH=9. A AfAA9_B é tolerante a Tween 20, SDS, SLS e Triton X-100, e a produtos de hidrólise como glicose e celobiose, apresentando mais de 80% da atividade residual. Por fim, em ensaios de atividade sob CMC na presença de outras GHs de A. fumigatus (também induzidas pela presença de SEB no meio de cultivo), foi constatado que a AfAA9_B não atua em sinergia com a celobiohidrolase AfCel6A, porém na presença de coquetel Celluclast® 1,5L e da endoglucanase Af-EGL7, a adição de LPMO foi responsável por aumentos de 3,5 e 8X na liberação de açúcares, respectivamente. Em ensaios de hidrólise com SEB e sabugo de milho, a suplementação da AfAA9_B resultou em aumento na degradação de 2X na presença de coquetel, e de 1,5X na presença da Af-EGL7, respectivamente. Tais resultados reforçam o potencial da AfAA9_B como enzima passível de ser adicionada em coquetéis comerciais e empregada em biorrefinarias com foco na produção de etanol 2G.