Caracterização e aptidão de mutantes PHO constitutivos em Escherichia coli

• Autor(a) principal: Pinto, Claudia Ramos de Carvalho
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-07032023-160000/
• topic: pst operon; aptidão; fitness; mutações PHO-constitutivas; mutation rate; operon pst; PHO regulon; PHO-constitutive mutations; regulon PHO; revertants; revertentes; taxa de mutação

Ortofosfato (Pi) é um dos macronutrientes mais abundantes na bactéria, sendo necessário para diversas funções celulares. Escherichia coli possui 3 sistemas de captação deste nutriente: PitA, PstSCAB-PhoU (Pst) e PhnCDE (Phn). Os dois últimos pertencem a um grupo de genes, conhecido como regulon PHO. Os genes deste regulon estão envolvidos em processos de captação e assimilação de Pi e e são regulados pelo sistema de dois componentes PhoB-PhoR. Mutações em qualquer um dos genes do operon pst e algumas mutações específicas em phoR causam a expressão constitutiva dos genes do regulon PHO. Essas mutações podem ser constituídas por substituições pontuais ou por inserções/deleções de base única ou de múltiplas bases. Mutantes que não regulam a expressão dos genes do regulon PHO são conhecidos como mutantes PHOconstitutivos. Tais mutantes podem ser selecionados em meio mínimo contendo glicerol-2-fosfato (G2P) como única fonte de carbono na presença de excesso de Pi. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar genética e molecularmente mutantes PHO-constitutivos em cepas derivadas de E. coli K-12, e correlacionar as mutações com o nível de aptidão destes mutantes. Para isso, foram isolados 255 mutantes: 76 derivados da cepa selvagem MG1655, 40 derivados do mutante MG1655 &#916phnCDE, 72 derivados do duplo mutante &#916phnCDE&#916pitA e 67 mutantes derivados da cepa MG1655 pitA::kan. Desses, 107 apresentaram grandes indels e os demais 148 mutantes portavam substituições ou pequenos indels; 90 mutações foram caracterizadas por sequenciamento e 148 tiveram o lócus da mutação identificado por meio de ensaios de complementação in trans. As mutações identificadas molecular e geneticamente ocorreram nos genes pstS (62%), pstC (9,8%), pstA (0,8%), pstB (22,3%) e phoR (5,1%). O nível de atividade da enzima fosfatase alcalina (FA), utilizada como repórter do nível de constitutividade do regulon PHO, foi medida em todos os mutantes. Os resultados sugerem que o nível de atividade da FA varia de acordo com o gene afetado, com o background genético da cepa ancestral e com o tipo de mutação.