Estudo da glucoamilase e da alfa-amilase produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii: purificação, caracterização bioquímica e relações filogenéticas

• Autor(a) principal: Michelin, Michele
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59139/tde-06072007-110106/
• topic: Amilase; Amilase; Paecilomyces variotii; Paecilomyces variotii; Termotolerante; Thermotolerance

Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii.