Fisiologia molecular digestiva de Musca domestica (DIPTERA)

• Autor(a) principal: Padilha, Marcelo Henrique Peteres
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10122009-135108/
• topic: Musca domestica; Musca domestica; Catepsina-D digestiva; Digestive cathepsin-D; ESTs; ESTs; Insects; Insetos; Lipase/esterase; Lipase/esterase

A mosca domestica (Musca domestica) é um dos insetos largamente distribuído e conhecido pelo homem. A larva de M. domestica possui no conteúdo luminal do ventrículo anterior e médio uma atividade proteolítica com pH ótimo entre 3,0 3,5 e propriedades cinéticas similares a catepsina-D. Três cDNAs codificantes para preprocatepsina-D (ppCAD1, ppCAD2 e ppCAD3) foram clonados a partir de uma biblioteca de cDNA ventricular de larvas de M. domestica. As sequências possuem o peptídeo sinal, o propeptídeo e a enzima madura contendo os resíduos catalíticos e todos os resíduos de ligação ao substrato conservados, achados em uma catepsina-D lisossomal bovina. Um cladograma de sequências de aminoácidos de catepsinas-D de insetos e vertebrados depositados no GENBANK formou um grande grupo dividido em duas ramificações monofiléticas: Uma com sequências de vertebrados e a outra com sequências de catepsinas-D lisossomais de insetos incluindo a ppCAD1. A sequência do pepsinogênio humana, ppCAD2, ppCAD3 e uma sequência de D. melanogaster são excluídas desse grande grupo indicando uma função não lisossomal para essas sequências. ppCAD3 deve corresponder a uma catepsina-D digestiva encontrada no conteúdo luminal em larvas do inseto devido: (1) Análise por RT-PCR indicam que os transcritos codificantes para a CAD3 são expressos no ventrículo anterior e porção proximal do ventrículo médio. (2) pCAD3 recombinante após autoativação sob condições ácidas possui um pH ótimo entre 2,5 3,0 que é próximo ao pH luminal do ventrículo médio onde essa enzima atua. (3) Imunoblots das proteínas de diferentes tecidos e marcadas com o anticorpo preparado contra a pCAD3 foi positiva apenas nos tecidos e conteúdo do ventrículo anterior e médio. (4) CAD3 é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção e próxima a microvilosidades nas células do ventrículo anterior e médio. Esses dados suportam a idéia que ao se adaptar a um hábito detritivo, a CAD digestiva da mosca (e de outros Diptera Cyclorrhapha) resultou do mesmo gene ancestral da catepsina-D lisossomal intracelular, da mesma forma que se acredita que ocorreu com a pepsina em vertebrados. Uma limitada quantidade de informações de sequências de DNA e aspectos moleculares de M. domestica é disponível até o presente momento. Nós então propusemos gerar sequências de ESTs a partir de uma bibilioteca de cDNA ventricular da larva desse inseto. Um total de 826 ESTs randomicamente selecionados presentes no ventrículos de larvas de M. domestica foram seqüenciados e analisados com programas de bioinformática e separado em 323 clusters. As sequências foram manualmente anotadas e separadas em 3 categorias: (S) produtos provavelmente secretados, (H) produtos de metabolismo em geral (housekeeping) e (U) produtos sem função conhecida. Cento e sessenta clusters (423 ESTs) codificavam para proteínas secretadas tais como: lisozimas, lipases, tripsinas, quimotripsinas, dipeptidades, carboxipeptidase e α-amilases. Cento e trinta e dois clusters (190 ESTs) codificavam para sequências de metabolismo em energético, síntese de proteínas, transdução de sinal e outras funções celulares. Noventa e cinco clusters (231 ESTs) codificaram para proteínas sem similaridades com proteínas conhecidas no banco de dados. Estudos de expressão, localização e imunocitoquímica de sequências alvos deverão no futuro nos fornecer um melhor entendimento da fisiologia digestiva da larva de Musca domestica em detalhes moleculares. Uma enzima lipolítica (LipMD) foi identificada no item anterior. A sequência de aminoácidos obtidas é homóloga a lipases e contém os três bem conservados resíduos de aminoácidos que compõe a tríade catalítica (Ser183, His273 e Asp208) para esse grupo de enzimas. O fragmento de cDNA codificante para a LipMD foi clonado em vetor pAE (Ramos et al., 2004) e expresso em E. coli produzindo uma enzima com massa molecular de 37,3 kDa. A LipMD recombinante foi purificada e é capaz de hidrolizar tributirina e um grande número de substratos (pNP-acetato a pNP-esterato) e possui um pH ótimo próximo de 7,5. Analise por RT-PCR mostrou que os transcritos codificantes para a LipMD são expressos apenas no ventrículo anterior. Western-blots após SDS-PAGE das proteínas de vários tecidos e marcados com o anticorpo produzido contra a LipMD revelou a ocorrência da enzima principalmente no conteúdo luminal do ventrículo anterior. A LipMD é localizada pela técnica de imuno-ouro no interior de vesículas de secreção próximas a microvilosidades no interior das células do ventrículo anterior. Esta enzima pode atuar como uma enzima lipolítica digestiva secretada nessa região do ventrículo de larvas de M. domestica