Pele humana como modelo ex vivo para manutenção do bacilo Mycobacterium leprae

• Autor(a) principal: Paula, Natalia Aparecida de
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-04102019-104640/
• topic: Cultura ex-vivo; Ex-vivo culture; hOSEC; hOSEC; Morfologia; Morphology; Mycobacterium leprae; Mycobacterium leprae; Viabilidade; Viability

Mycobacterium leprae (M. leprae), descrito como causador da hanseníase em 1873, ainda hoje não há meios de cultivá-lo artificialmente in vitro, sendo que atualmente a única forma de mantêlo viável e replicando-se é a inoculação in vivo, principalmente em camundongos nude, porém trata-se de um modelo in vivo, trabalhoso e demorado. Esse trabalho propõe padronizar o cultivo do M. leprae, em modelo ex vivo, a partir de explantes de pele humana (hOSEC - human organotypic skin explant culture) tanto para ensaios laboratoriais quanto para auxílio clínico. Para isso, M. leprae, cepa Thai-53, obtido de camundongos nude, foi inoculado em fragmentos de pele humana e mantidos em placas com meio de cultura DMEM, a 5% de CO2. A manutenção, crescimento e morfologia dos bacilos nos explantes foram avaliadas após os períodos de cultura (4, 7, 14, 28 e 60 dias) por coloração de Fite-Faraco (FF) e por biologia molecular (RLEP/16s rRNA). Após 28 e 60 dias de cultura, bacilos foram recuperados dos explantes e inoculados na pata de camundongo nude para avaliar manutenção da viabilidade e infectividade. À coloração FF, bacilos foram encontrados em todos os tempos nas formas bacilar íntegra e fragmentada, isolados ou formando alguns aglomerados e raras globias. A viabilidade bacilar foi demonstrada pela positividade da RT-PCR para 16s rRNA em todos os explantes em todo o período de cultura. Dentre os animais inoculados com os bacilos previamente cultivados nos explantes por 28 e 60 dias, após manutenção por 5 meses, 28,4% apresentaram-se positivos para os bacilos, em pelo menos uma das técnicas utilizadas, FF (31,8%), Zihel-Neelsen em suspensão de macerado da pata (77,3%) e RT-PCR (45%). Suspensão de bacilos oriundas de raspados dérmicos e hansenomas de pacientes, foram inoculadas nos explantes e cultivados da mesma maneira já citada, mantendose positivas ao FF e RT-PCR após cultivo médio de 28 dias. Os bacilos de amostras clínicas também foram recuperados dos explantes e inoculados nos camundongos e também apresentaram positividade após cinco meses de manutenção in vivo. Pela primeira vez na literatura, nossos 9 resultados demonstraram com sucesso que é possível manter o M. leprae viável no modelo de pele humana ex vivo por até 60 dias, tanto a partir de amostras laboratoriais quanto clínicas, importante passo no desenvolvimento de modelos experimentais para estudos da biologia do M. leprae e suas interações, além de clínicos, como imunologia e susceptibilidade a drogas