Expressão do complexo troponina em E. coli e mapeamento dos domínios funcionais da troponina T

• Autor(a) principal: Malnic, Bettina
• Data de Publicação: 1995
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-03042012-121955/
• topic: Biologia molecular; Complexo troponina; Estrutura de proteínas; Molecular biology; Protein structure; Troponin complex; Troponin T; Troponina T

A contração muscular esquelética é regulada pelo complexo troponina/tropomiosina de maneira dependente de Ca2+. O complexo troponina consiste de três subunidades: a troponina C (TnC), a troponina I (TnI) e a troponina T (TnT). A troponina C é a subunidade que liga Ca2+, a TnI é a subunidade inibitória e a TnT liga-se fortemente à tropomiosina. A TnI e a TnT são altamente insolúveis a baixas forças iônicas, a não ser que estejam complexadas com a TnC. O complexo troponina pode ser reconstituído \"in vitro\" a partir das subunidades isoladas simplesmente misturando-se as subunidades em razões equimolares em uréia, que depois é removida através de diálise. Na primeira parte deste trabalho um vetor para a co-expressão da TnC, TnI e TnT em E.coli foi construído. Utilizando este vetor nós produzimos um complexo troponina funcional montado no citoplasma de E.coli. A presença da TnT é requerida para regulação dependente de Ca2+ da contração muscular esquelética. O papel da TnT em conferir sensibilidade ao Ca2+ à atividade ATPásica da acto-miosina foi analisado. Mutantes de deleção da TnT foram construídos através de mutação sítio-dirigida e expressos em E.coli. Complexos troponina contendo os mutantes de TnT e/ou mutantes de TnI foram reconstituídos e analisados em ensaios de ligação ao filamento fino e ensaios de atividade ATPásica. Baseado nestes resultados a TnT foi subdividida em três domínios: o domínio ativatório (aminoácidos 157-216), o domínio inibitório (aminoácidos 157-216) e o domínio de ancoragem do dímero TnC/TnI (aminoácidos 216-263). Nós demonstramos que o dímero TnC/TnI está ancorado ao filamento fino através da interação entre a região amino-terminal da TnI e da região carbóxi-terminal da TnT (aminoácidos 216-263). Um modelo para o papel da TnT na regulação da contração muscular dependente de Ca2+ é proposto.