Estudo fitoquímico, desenvolvimento de método analítico e avaliação biológica de própolis marrom do sudeste brasileiro produzida por Apis mellifera

• Autor(a) principal: Ribeiro, Victor Pena
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60138/tde-18052022-105131/
• topic: Analytical methods; Brown propolis; Cromatografia líquida e gasosa; Liquid and gas chromatography; Métodos analíticos; Propolis marrom; Validação; Validation

A própolis tem sido objeto de diversos estudos farmacológicos devido às propriedades biológicas importantes como antioxidante e antiflamatória, entre outras, sendo uma importante alternativa terapêutica, do ponto de vista econômico, por ser farmacologicamente eficiente e de fácil obtenção. Os principais tipos de própolis Brasileiras são: verde, vermelha, amarela e marrom. Apesar da importância comercial, histórica e econômica da própolis brasileira, a composição química da própolis marrom tem sido escassamente investigada. Todas as propriedades biológicas atribuídas a própolis, são fortemente dependentes da concentração de constituintes ativos. Assim, a investigação química e a padronização dos produtos de própolis são fundamentais devido às variabilidades nos perfis químicos dos extratos. Diante disso, o objetivo do trabalho foi investigar a composição química, desenvolver e validar métodos cromatográficos para quantificação dos marcadores e avaliar a atividade biológica de amostras de própolis marrom produzida por Apis mellifera coletadas na região sudeste do Brasil. Amostras de própolis marrom foram coletadas no apiário Sol, localizado no município de Cabo Verde - MG, utilizando-se coletores de madeira vazados nas tampas das colmeias de Apis Mellifera. A partir da própolis, foi obtido o extrato bruto através de maceração com soluções hidroalcoolicas. O Extrato bruto foi submetido a partições com solventes de polaridade crescentes e posteriormente foi submetido a diferentes técnicas cromatográficas para isolamento dos compostos majoritários. As substâncias isoladas tiveram suas estruturas determinadas por meio de técnicas como RMN. Da fração fixa foram isoladas e identificadas 15 substâncias que foram utilizadas no desenvolvimento e validação de um método por HPLC/DAD. A validação levou em consideração parâmetros estabelecidos nos guias de agências como ANVISA e ICH. O extrato bruto foi avaliado quanto a citotoxidade celular frente a linhagens normais e tumorais, atividade frente a Leishimania amazonenses e Plasmodium falciparum. A avaliação citotóxica do extrato hidroalcoólico, não indicou efeito sobre a viabilidade das linhagens celulares normais (VERO e LLC-PK1), contudo, a própolis marrom exibiu efeito de toxicidade nas células tumorais, com os seguintes valores de IC50: 80 µg/mL para SK-MEL; 82 µg/mL para KB; 71 µg/mL para SK-OV-3; e 64 µg/mL para BT-549. A própolis marrom apresentou atividade leishimanicida promissora, com IC50 de 1,8 µg/mL contra a forma promastigota de L. amazonensis e IC50 de 2,4 µg/mL contra a forma amastigota. Sobre a atividade antiplasmódica, a própolis marrom apresentou atividade contra cepas de P. falciparum, com IC50 de 18,1 µg/mL e 15,6 µg/mL, contra as cepas D6 e W2 respectivamente. A fração volátil da Propolis marrom, também foi considerada neste trabalho, para tanto a própolis foi submetida a hidrodestilação para obtenção da fração volátil. Essa fração foi fracionada por spinning band distillation e duas frações submetidas a cromatografia em coluna aberta para isolamento dos compostos majoritários. As substâncias isoladas tiveram suas estruturas determinas por meio de RMN e espectrometria de massas. Foram isoladas e identificadas 8 substâncias voláteis que foram utilizadas no desenvolvimento e validação do método por CG-DIC os quais foram considerados os parâmetros estabelecidos nos guias de validação da ANVISA e ICH. A fração volátil apresentou atividade leishmanicida significativa, com IC50= 21,3 µg/mL contra formas amastigotas e IC50= 25,1 µg/mL contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis. Essa fração também apresentou efeito antibacteriano ao inibir o crescimento de Streptococcus mutans e Staphylococcus aureus a 25 µg/mL e 50 µg/mL, respectivamente, mas não foi citotóxico contra as linhagens AGP-01, He-La e CHO-K1, com IC50> 100 µg/mL. O extrato bruto e a fração volátil da própolis marrom, tiveram suas propriedades analgésica e anti-inflamatória avaliadas por meio do teste de formalina e hipernocicepção mecânica induzida por carragenina. O extrato hidroalcoólico e a fração volátil foram avaliados nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg. No teste de formalina, o extrato bruto reduziu a resposta em 73 ± 7%, 83 ± 8%, e 89 ± 3% para a primeira fase e 48 ± 13%, 65 ± 9%, e 75 ± 6% para a segunda fase, respectivamente. A fração volátil reduziu a resposta em 75 ± 7%, 94 ± 5%, 99 ± 1% e 30 ± 7%, 53 ± 5%, 91 ± 5% para a primeira e segunda fase respectivamente. Para o teste de carragenina, o extrato hidroalcoólico e a fração volátil apresentaram reduções na sensibilização mecânica de 57 ± 7%, 67 ± 6%, 79 ± 5% e 62 ± 7%, 79 ± 9%, 88 ± 4% respectivamente, após 48 h. A indometacina e a morfina apresentaram inibições de 42 ± 4% and 88 ± 2%, respectivamente. No ensaio de movimento de cauda, os resultados mostraram evidências de atividades analgésicas; os animais tratados com extrato bruto aumentaram o limiar nociceptivo em 58±8% e 70±6% e 77±10%, respectivamente, para as doses avaliadas, e 55±6% e 73±7% e 82±14% para a fração volátil, em comparação com o controle. A coadministração de naloxona alterou o efeito antinociceptivo da morfina e da própolis, sugerindo que a própolis marrom tem ação no sistema nervoso central. Uma própolis marrom coletada na cidade de Angatuba - SP teve sua composição química elucidada, para tanto, foi obtido o extrato bruto através de maceração com soluções hidroalcoolicas que foi submetido a partições e posteriormente a diferentes técnicas cromatográficas para isolamento dos seus constituintes. As substâncias isoladas tiveram suas estruturas determinas por meio de RMN. A composição química dessa própolis se apresntou complexa e diferente das reportadas na literatura. Foram isoladas e identificadas 16 substâncias dessa própolis marrom, incluindo sete compostos fenólicos, um flavanonol, duas lignanas e seis ácidos/álcool diterpênicos. O perfil químico dessa própolis indica que Pinus spp., Eucalyptus spp. e Araucaria angustifolia podem ser sua principal fonte vegetal. A própolis marrom apresentou atividade significativa contra as cepas de Plasmodium falciparum D6 e W2 com IC50 de 5,3 e 9,7 µg/mL, respectivamente. A fração volátil dessa própolis também foi ativa com IC50 de 22,5 e 41,8 µg/mL, respectivamente. Entre os compostos, 1-O,2-O-digalloil-6-O-trans-p-cumaroil-β-D-glicopiranosídeo apresentou IC50 de 3,1 e 1,0 µg/mL contra as cepas D6 e W2, respectivamente, enquanto o ácido comúnico apresentou um IC50 de 4,0 µg/mL contra a cepa W2. A citotoxicidade foi determinada em quatro linhas de células tumorais (SK-MEL, KB, BT-549 e SK-OV-3) e duas linhas de células renais normais (LLC-PK1 e VERO). Matairesinol, 7-O-metil aromadendrina e ácido isopimárico apresentaram uma faixa de IC50 de 1,8 - 0,78 µg/mL, 7,3 - 100 µg/mL e 17-18 µg/mL, respectivamente, contra as linhagens de células tumorais, mas não foram citotóxicos contra linhagens celulares normais. O extrato bruto de própolis marrom apresentou atividade antimicrobiana contra C. neoformans, Staphylococcus aureus resistente à meticilina e P. aeruginosa em 29,9 µg/mL, 178,9 µg/mL e 160,7 µg/mL, respectivamente. A fração volátil inibiu o crescimento de C. neoformans em 53,0 µg/mL. A própolis marrom possui uma variedade química maior do que outros tipos de própolis brasileiras, uma vez que várias fontes botânicas possíveis são listadas. Portanto, a própolis marrom brasileira apresenta grande potencial e deve ser mais investigada para viabilizar sua produção e comercialização como produto eficaz e seguro para a saúde.