Expressão de troponina I do musculo esqueletico de galinha em E. coli

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Quaggio, Ronaldo Bento
Data de Publicação: 1991
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-01112012-153354/
Resumo: Da interação da actina com a miosina resulta a contração muscular. Esta interação é controlada pela concentração de íons cálcio, que atuam sobre um sistema regulatório associado ao filamento de actina. O sistema regulatório é composto de uma molécula de tropomiosina e um complexo protéico composto de três polipeptídeos chamado troponina. Uma das subunidades, troponina C, e o receptor de ions cálcio; outra, troponina T, liga-se à tropomiosina; e a terceira, troponina I, é a responsável pela inibição da atividade ATPásica da actomiosina. Esta dissertação descreve o desenvolvimento do processo de expressão da troponina I em bactéria, sua purificação e caracterização. Partindo de um cDNA de troponina I músculo esquelético de galinha, procedemos à construção de um vetor de expressão da proteína em E.coli com o sistema pET. Inicialmente construímos um vetor de expressão capaz de produzir a troponina I fundida a 18 aminoácidos. A proteína foi purificada e caracterizada, comportando-se de forma semelhante à troponina I selvagem. Numa segunda etapa, foram feitas mutações sítio-dirigidas para a construção de um novo sítio de restrição que possibilitou construir um vetor de expressão da troponina I a partir de sua metionina inicial. Entretanto não foi obtida expressão com esta construção. Para solucionar o problema, foram feitas novas mutações que alteraram os codons AGG presentes nos 25 primeiros codons do gene da proteína por codons CGT, sem alterar o aminoácido codificado. Nesta construção final foi obtida a expressão da proteína sem fusão, que purificada e caracterizada, comporta-se de modo idêntico à troponina I selvagem.
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