Produção de L-asparaginase por Pichia pastoris em cultivos descontínuos-alimentados em biorreatores.

• Autor(a) principal: Parizotto, Letícia de Almeida
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-26082022-080221/
• topic: Auxotrophy; Bioprocessos; Bioreactors; Carbon balance; Engenharia química; Experimental planning; L-Asparaginase (ASNase); Pichia pastoris; Proteínas recombinantes; Reatores bioquímicos

O Brasil é altamente dependente da importação de medicamentos biológicos, o que implica em risco de desabastecimento e dependência dos preços da flutuação cambial. Recentemente, a falta de insumos tem levado a rupturas no estoque do biofármaco Lasparaginase (ASNase), que é utilizado no tratamento de vários cânceres, em especial, da Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), um dos principais tipos de câncer infantil. Apesar de dois medicamentos já terem sido registrados desde 2018, o fornecimento não é confiável. Ademais, as formas de ASNase aprovadas para uso clínico são derivadas de bactérias, Escherichia coli e Dickeya chrysanthemi (Erwinia chrysanthemi), e todas causam reações imunológicas nos pacientes e possuem tempo de meia-vida de apenas algumas horas. Portanto, foram estabelecidos projetos temáticos visando a desenvolver os primeiros passos para a produção nacional de uma ASNase menos imunogênica e mais estável. Em colaboração com esses projetos, esta tese objetiva o desenvolvimento da etapa de upstream do processo de produção da enzima recombinante L-asparaginase de D. chrysanthemi expressa por uma cepa de Pichia pastoris (Glycoswitch®) capaz de realizar glicosilação humanizada, desde a geração da linhagem celular até os cultivos em biorreator de bancada. Para alcançar esse objetivo, foi desenvolvida uma nova cepa produtora e foram realizadas melhorias nas estratégias operacionais do processo. Primeiramente, foram transformadas duas cepas da Glycoswitch®, uma auxotrófica (His-) e outra prototrófica (His+) para histidina, caracterizadas em termos da expressão do gene ansB, codificante da ASNase, e estudadas as condições de cultivo em meio complexo em frascos e em meio sintético em biorreator de 2 L. A análise de qPCR mostrou que a cepa His+ possui o dobro de expressão gênica que a His-, o que foi condizente com a produtividade obtida em frascos e em biorreator, portanto ela foi selecionada para a continuidade do estudo. Em seguida, o protocolo de indução em biorreator foi modificado do controle da alimentação do indutor (metanol) de malha aberta em pulsos para malha fechada com DO-stat, o que resultou no dobro da atividade volumétrica. Posteriormente, adotando princípios de Quality by Design, como planejamento experimental, aplicação de ferramentas analíticas e análise com modelos matemáticos, foi realizado um delineamento estatístico para investigar os efeitos da concentração controlada de metanol, oxigênio dissolvido e temperatura sobre a atividade volumétrica da ASNase. Na melhor condição de cultivo, 5 g/L de metanol, 50% de oxigênio dissolvido e 35 oC, foi obtida atividade volumétrica final de 10700 U/L com 84 horas de processo, cerca de oito vezes maior do que em malha aberta. Além disso, o modelo preditivo revelou que o controle do metanol e o aumento da temperatura foram essenciais para esse resultado. Por meio de balanço de carbono foram calculados os coeficientes de conversão a biomassa e produto e observou-se que a temperatura mais alta resultou no aumento deles, o que favoreceu a formação de ASNase ativa. Finalmente, a caracterização da ASNase recombinante por análise MALDI-TOF revelou que ela é glicosilada em um epítopo causador de respostas imunológicas nos pacientes, provavelmente reduzindo seus efeitos colaterais. Portanto, foi desenvolvido um protocolo com alto rendimento de uma ASNase inovadora comparado a outros trabalhos já publicados, que tem potencial de prover um tratamento com mais qualidade de vida para o paciente.