Análise do papel da endonuclease XPG na transcrição nuclear e na integridade do genoma mitocondrial

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Mendes, Davi
Data de Publicação: 2024
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-18072024-102141/
Resumo: Os mecanismos de reparo do DNA são vitais para manter a integridade genômica e prevenir o acúmulo de lesões no DNA que podem levar a uma ampla gama de doenças, como câncer, distúrbios relacionados ao envelhecimento e neurodegeneração. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é um dos principais sistemas de reparo do DNA responsáveis por reconhecer e reparar uma variedade de lesões no DNA causadas pela exposição à radiação UV, agentes químicos ou estresse redxox. Deficiências em proteínas de NER podem resultar em distúrbios como o Xeroderma Pigmentosum (XP), caracterizado por extrema sensibilidade à luz UV e um aumento no risco de câncer de pele, e como a Síndrome de Cockayne (CS), doença associada a graves sintomas neurológicos e envelhecimento prematuro. Para investigar os papéis das proteínas de NER, como XPG, na resposta ao estresse redox, linhagens celulares foram geradas por transdução de alelos XPG WT e XPG RJ2 (XP) em uma linhagem celular deficiente em XPG, oriunda de um paciente XP/CS. Primeiramente, as linhagens foram avaliadas após exposição à UV, seguida por avaliação em níveis basais e após estresse redox. Vários parâmetros celulares foram avaliados, incluindo viabilidade celular, ciclo celular e níveis de &#947H2AX. Sondas fluorescentes, anticorpos direcionados a proteínas mitocondriais e análises de imunofluorescência foram utilizados para examinar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), características mitocondriais e sensibilidade ao estresse redox. Host cell reactivation (HCR) foi empregado para avaliar a capacidade de NER enquanto ensaios de cometa alcalino, combinados com tratamento enzimático de Fpg, permitiram a avaliação de quebras no DNA, bases oxidadas, e a cinética de reparo. Os resultados deste projeto forneceram importantes dados sobre o impacto dos alelos XPG no estresse redox, parâmetros mitocondriais e metabolismo celular. Observou-se que o alelo XPG WT aumentou a sobrevivência e reduziu o estresse redox celular sem aumentar as defesas redox, enquanto a produção de ERO não demonstra ser resultado de disfunção mitocondrial. Curiosamente, células XPG WT apresentaram melhora na respiração mitocondrial e não mitocondrial, sugerindo um potencial benefício metabólico devido à complementação. Por outro lado, o alelo XPG RJ2 aumentou a morte celular, demonstrou perfil semelhante às células XPG/CS, exceto por uma melhoria metabólica parcial com aumento na capacidade de reserva e respiração máxima. Além disso, células XPG/CS exibiram aumento na expressão da piruvato desidrogenase (PyD), provavelmente uma resposta adaptativa para sobreviver ao estresse redox. A origem dessa resposta ainda precisa ser elucidada, e investigações adicionais são necessárias para descobrir os mecanismos subjacentes a essas observações. Essas descobertas lançam luz sobre as relações intricadas entre sistemas de reparo do DNA, respostas celulares ao estresse redox e a manutenção da integridade genômica. Compreender os papéis das proteínas de NER nesses processos tem importantes implicações para ajudar a elucidar os mecanismos de reparo do DNA e suas contribuições para a neurodegeneração e o envelhecimento.
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Deficiências em proteínas de NER podem resultar em distúrbios como o Xeroderma Pigmentosum (XP), caracterizado por extrema sensibilidade à luz UV e um aumento no risco de câncer de pele, e como a Síndrome de Cockayne (CS), doença associada a graves sintomas neurológicos e envelhecimento prematuro. Para investigar os papéis das proteínas de NER, como XPG, na resposta ao estresse redox, linhagens celulares foram geradas por transdução de alelos XPG WT e XPG RJ2 (XP) em uma linhagem celular deficiente em XPG, oriunda de um paciente XP/CS. Primeiramente, as linhagens foram avaliadas após exposição à UV, seguida por avaliação em níveis basais e após estresse redox. Vários parâmetros celulares foram avaliados, incluindo viabilidade celular, ciclo celular e níveis de &#947H2AX. Sondas fluorescentes, anticorpos direcionados a proteínas mitocondriais e análises de imunofluorescência foram utilizados para examinar a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), características mitocondriais e sensibilidade ao estresse redox. Host cell reactivation (HCR) foi empregado para avaliar a capacidade de NER enquanto ensaios de cometa alcalino, combinados com tratamento enzimático de Fpg, permitiram a avaliação de quebras no DNA, bases oxidadas, e a cinética de reparo. Os resultados deste projeto forneceram importantes dados sobre o impacto dos alelos XPG no estresse redox, parâmetros mitocondriais e metabolismo celular. Observou-se que o alelo XPG WT aumentou a sobrevivência e reduziu o estresse redox celular sem aumentar as defesas redox, enquanto a produção de ERO não demonstra ser resultado de disfunção mitocondrial. Curiosamente, células XPG WT apresentaram melhora na respiração mitocondrial e não mitocondrial, sugerindo um potencial benefício metabólico devido à complementação. Por outro lado, o alelo XPG RJ2 aumentou a morte celular, demonstrou perfil semelhante às células XPG/CS, exceto por uma melhoria metabólica parcial com aumento na capacidade de reserva e respiração máxima. Além disso, células XPG/CS exibiram aumento na expressão da piruvato desidrogenase (PyD), provavelmente uma resposta adaptativa para sobreviver ao estresse redox. A origem dessa resposta ainda precisa ser elucidada, e investigações adicionais são necessárias para descobrir os mecanismos subjacentes a essas observações. Essas descobertas lançam luz sobre as relações intricadas entre sistemas de reparo do DNA, respostas celulares ao estresse redox e a manutenção da integridade genômica. Compreender os papéis das proteínas de NER nesses processos tem importantes implicações para ajudar a elucidar os mecanismos de reparo do DNA e suas contribuições para a neurodegeneração e o envelhecimento.DNA repair mechanisms are vital for maintaining genomic integrity and preventing the accumulation of DNA lesions that can lead to a wide range of diseases, including cancer, aging-related disorders, and neurodegenerative conditions. Nucleotide excision repair (NER) is one of the key DNA repair systems responsible for recognizing and repairing a variety of DNA lesions caused by exposure to UV radiation, chemical agents, or oxidative stress. Deficiencies in NER proteins can result in disorders such as Xeroderma Pigmentosum (XP), characterized by extreme sensitivity to UV light and an increased risk of skin cancer, and Cockayne Syndrome (CS), associated with severe neurodevelopmental and premature aging features. To investigate the roles of specific NER proteins, such as XPG, in dealing with redox stress, cell lines were generated by transducing XPG WT and XPG RJ2 (XP) alleles to a cell line XPG deficient, from a XP/CS patient. First, they were evaluated after UV exposure, followed by assessment at basal levels and after redox stress. Various cellular parameters were evaluated, including cell viability, cell cycle and &#947H2AX levels. Fluorescent probes, antibodies targeting mitochondrial proteins, and immunofluorescence analysis were utilized to examine radical oxygen species (ROS) production, mitochondrial features, and redox stress sensitivity. Host cell reactivation (HCR) assay was employed to evaluate NER capacity, while alkaline comet assays, combined with Fpg enzyme treatment, allowed the assessment of DNA breaks, oxidized bases, and repair kinetics. The results of this study provided important insights into the impact of XPG alleles on redox stress, mitochondrial parameters, and cellular metabolism. It was observed that the XPG WT allele increased survival and reduced cellular oxidative stress without increasing redox defenses, while ROS production did not result from mitochondrial dysfunction. Interestingly, XPG WT cells exhibited improved mitochondrial and non-mitochondrial respiration, suggesting a potential metabolic benefit due to complementation. In contrast, XPG RJ2 increased cell death, demonstrated similar profile of XPG/CS cells, except by a partial metabolic improvement with increased spare capacity and maximal respiration. Furthermore, XPG/CS cells exhibited increased pyruvate dehydrogenase (PyD) expression, likely in an adaptive response to survive redox stress. The exact trigger for this response remains to be elucidated, and further investigations are needed to uncover the underlying mechanisms driving these observations. These findings shed light on the intricate relationships between DNA repair systems, cellular responses to redox stress, and the maintenance of genomic integrity. Understanding the roles of specific NER proteins in these processes has important implications for help elucidating the mechanisms of DNA repair and their contributions to neurodegeneration and aging.Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USPMenck, Carlos Frederico MartinsMendes, Davi2024-02-07info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfhttps://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-18072024-102141/reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USPinstname:Universidade de São Paulo (USP)instacron:USPReter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais.info:eu-repo/semantics/openAccesspor2024-07-18T14:06:02Zoai:teses.usp.br:tde-18072024-102141Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://www.teses.usp.br/PUBhttp://www.teses.usp.br/cgi-bin/mtd2br.plvirginia@if.usp.br|| atendimento@aguia.usp.br||virginia@if.usp.bropendoar:27212024-07-18T14:06:02Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP - Universidade de São Paulo (USP)false
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