Caracterização genômica e funcional do lncRNA RMEL3 em melanoma

• Autor(a) principal: Andrade, Barbara Yasmin Garcia
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-17112023-100426/
• topic: Apoptose; Apoptosis; ENSG00000250961; ENSG00000250961; HIPPO; Immunogenicity; Imunogenicidade; Inflamação; Inflammation; lncRNA; lncRNA; MAPK; MAPK; Melanoma; Melanoma; Migração e invasão; Migration and invasion; PI3K; PI3K; Resposta sérica; RMEL3; RMEL3; Serum response; Via de HIPPO

Os RNAs não-codificantes (lncRNAs) constituem uma classe de RNAs diversificados que nos últimos anos tem atraído grande interesse devido ao seu papel em diversos processos celulares fisiológicos e patológicos, como câncer, doenças inflamatórias e degenerativas. O lncRNA RMEL3 é enriquecido em melanoma, particularmente naqueles portadores da mutação BRAFV600E e com fenótipo marcadamente invasivo. No presente trabalho, detectamos pelo menos nove variantes transcritas do locus do gene RMEL3 (ENSG00000250961) expressas na linhagem celular de melanoma BRAFV600E A375, através da amplificação dos transcritos por RT-PCR, e ensaios 3\'RACE e 5\'RACE. Através de ensaios de hibridização in situ (RNA-FISH), demonstramos que transcritos RMEL3 são detectados no núcleo e citoplasma, apresentando uma ampla distribuição citoplasmática em células A375, SKMEL28 e WM902B. O silenciamento mediado por shRNA de RMEL3 reduziu as taxas de formação de colônia e proliferação e reduziu os níveis de fosforilação das proteínas efetoras ERK1/2 e AKT das vias MAPK e PI3K, respectivamente. O silenciamento de RMEL3 também levou ao aumento da apoptose nas células A375, o que foi consistente com a expressão reduzida da proteína antiapoptótica BCL2. Além disso, reduziu a capacidade migratória e invasiva das células A375, bem como a expressão de proteínas importantes que conferem o caráter invasivo das células. Com o objetivo de elucidar os mecanismos moleculares da função de RMEL3, validamos as proteínas ARAF, MST2/STK3 e FAM83D como ligantes de RMEL3 por pulldown seguido por western blot e imunoprecipitação de RNA complexado a essas proteínas. Para entender a influência de RMEL3 no programa global de expressão gênica em resposta ao soro em células A375, usamos sequenciamento de próxima geração em larga escala (RNAseq). No total, as células silenciadas apresentaram expressão alterada de 2370 genes (FDR p-valor < 0,05, log2 fold change < -1 ou >1), dos quais 804 genes apresentaram log2 fold change < -2 ou > 2, sendo 278 genes com expressão aumentada (log2 fold change > 2) e 526 com expressão reduzida (log2 fold change < - 2). A análise do enriquecimento de vias de genes regulados implica RMEL3 em vias de sinalização, como PI3K-AKT, HIPPO supressor tumoral, AMPK, ácido lisofosfatídico, adesão focal, apoptose e, curiosamente, várias vias imunogênicas e inflamatórias. Com os resultados deste trabalho, buscamos contribuir para uma anotação precisa do gene RMEL3 e elucidação dos mecanismos pelos quais as isoformas melanocíticas exercem suas atividades funcionais.