PCR Multiplex SNaPshot para detecção das variantes D parciais e D fracos na Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto

• Autor(a) principal: Ribeiro, Carolina Madeira
• Data de Publicação: 2024
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17155/tde-13052024-153727/
• topic: Genotipagem RhD; Multiplex PCR; PCR multiplex; RhD genotyping; RhD variantes; RHD variants; SNaPshot; SNaPshot

Na prática diagnóstica da imunohematologia, especialmente relacionada ao grupo sanguíneo Rh, a hemaglutinação é amplamente empregada, embora apresente limitações notáveis. A detecção de variantes RhD fraco e parcial é uma preocupação comum nos serviços de banco de sangue, uma vez que a hemaglutinação revela a alteração da expressão do antígeno RhD, podendo haver a presença de uma variante RhD, mas não especifica qual variante está presente. Este desafio tem sido superado com o uso de ensaios moleculares, que possibilitam caracterizar corretamente as amostras com variantes RhD. Porém, a metodologia empregada atualmente para a genotipagem RhD é trabalhosa, demorada ou requer grandes investimentos financeiros. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um ensaio molecular para a detecção simultânea das variantes RHD fraco e RHD parcial mais prevalentes em Ribeirão Preto e região. Com este propósito foi padronizada uma reação de PCR multiplex para amplificação específica dos Exons 1, 4, 6, 7, 8 e 9 do gene RHD. Em seguida, o produto amplificado foi avaliado pela tecnologia SNaPshot de análise de fragmentos. O desenvolvimento do ensaio envolveu etapas cuidadosas de padronização de PCR, extensão e calibração da eletroforese capilar e análise de fluorescência, para garantir precisão na identificação das variantes RhD. Nossos resultados mostraram que os primers utilizados são específicos para o gene RHD e que a reação de PCR multiplex estabelecida permite amplificar com eficiência os exons 4, 6, 7, 8 e também os exons 1 e 9 nas mesmas condições de ciclagem. Após a reação SNaPshot foi possível identificar amostras com as variantes RHD* 01w (fraco tipo 1) (c.809 T>G), RHD*02w (fraco tipo 2) (c.1154 G>C), RHD*03 w (fraco tipo 3) (c.8C>G) e RHD* fraco/parcial tipo 4 (c.602 C>G). Além disso, a reação SNaPshot também permitiu identificar simultaneamente RHD* fraco tipo 15 (c.845 G>A) e outros SNVs que ajudam na classificação de variantes RhD parciais, como c.819 G>A característico das variantes DIII e DAR, c.1025 T>C presente em DAR, DIV, DBT e RHD* fraco tipo 29 e c.1136 C>T encontrado na variante DAU. A validação do ensaio, corroborou com resultados prévios de amostras com genotipagem conhecida por PCR-AS, e permitiu classificar as amostras RhD variantes de nossa região. Em conclusão, o ensaio SNaPshot desenvolvido neste trabalho emerge como uma ferramenta valiosa para a elucidação precisa das variantes do gene RHD, e contribui para o avanço na genética hematologia e imunohematologia.