Estudo da glicosiltransferase LafB de Enterococcus faecium envolvida na supersensibilidade à daptomicina

• Autor(a) principal: Esquén, Pamela Ibeth Huanambal
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-18082022-093004/
• topic: Enterococcus faecium; Enterococcus faecium; Daptomycin hypersusceptibility; Glicosiltransferase LafB; Glycosyltransferase LafB; Hipersensibilidade à daptomicina

Devido a crescente onda de resistência bacteriana a nível global, a Organização Mundial da Saúde classificou grupos de bactérias multidroga resistentes quanto à prioridade para a pesquisa e desenvolvimento de novos antibióticos, dentre os quais Enterococcus faecium resistentes à vancomicina (VRE) se encontra classificado como alta prioridade. Entre as opções terapêuticas de último recurso para combater infecções causadas por VRE está daptomicina (DAP), no entanto, a resistência a este antibiótico em VRE já foi relatada. Recentemente, pesquisadores do IFSC-USP detectaram que uma mutação no gene lafB de E. faecium causou hipersensibilidade a DAP. O gene lafB codifica a glicosiltransferase LafB, envolvida na via de formação da âncora do ácido lipoteicóico (LTA), que também está presente em outras bactérias gram-positivas como Listeria monocytogenes e Enterococcus faecalis. Deste modo, este trabalho procurou verificar o papel da mutação do gene lafB no fenótipo bacteriano, caracterizar biofisicamente a proteína, e estudar in-silico uma predição da estrutura tridimensional da LafB, pois é um alvo promissor para aumentar a atividade da DAP em bactérias gram-positivas. Para isso, foi feita uma comparação entre as linhagens de HBSJRP 18_2.1 (supersensível a DAP) e HBSJRP 18_2.7 (sensibilidade normal a DAP) acerca do crescimento bacteriano, perfil metabólico, capacidade de formação de biofilme e virulência in-vivo em modelo de Galleria mellonella. A mutação em lafB causou uma significativa queda no crescimento bacteriano e virulência da linhagem supersensível, porém, não apresentou diferença significativa na capacidade de formação de biofilme, nem nas condições metabólicas analisadas. Concomitantemente, foi feita a clonagem, expressão e purificação por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular da proteína LafB nativa e mutada. Ao contrário da LafB nativa, a proteína mutada é insolúvel nos passos de purificação nas mesmas condições de tampão e temperatura. Com amostras purificadas da proteína LafB nativa, se realizaram ensaios de dicroísmo circular e SEC-MALS. Sob condições in-vitro, LafB é monomérica, possui uma massa molecular de 41.76 kDa, temperatura de Melting de 37 °C, e possui estruturas secundárias -helicoidais. Para a análise in-silico, a estrutura tridimensional da proteína foi predita usando o software AlphaFold, adicionalmente, foi feito um acoplamento entre a estrutura predita da proteína e o ligante hipotético UDP-galactose. Os resultados sugerem que estruturalmente a LafB pertence às glicosiltransferases da família GTB, e que devido ao fato de a mutação estar próxima ao suposto sítio catalítico, é provável que as mudanças nas interações que ocorrem entre os aminoácidos da proteína e ligante, sejam a causa das mudanças observadas no fenótipo da linhagem mutada. No futuro, testes com diferentes condições de purificação serão feitos para estabilizar e cristalizar a proteína para resolver sua estrutura tridimensional, a fim de entender mais a fundo o papel da proteína LafB na sensibilidade a daptomicina.