Impacto da inativação de genes relacionados à síntese de produtos de fermentação (lactato e acetato) na produção de 1,3-propanodiol em linhagens de Escherichia coli recombinantes

• Autor(a) principal: Oliveira, Henrique da Costa
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-06062019-141357/
• topic: 1,3-propanediol; 1,3-propanodiol; Escherichia coli; Escherichia coli; yqhD; yqhD; Acetate; Acetato; Glicerol; Glycerol

Este projeto teve como objetivo a produção de 1,3-propanodiol (1,3-PDO) utilizando glicerol como matéria prima, que pode ser proveniente da indústria de biodiesel. O 1,3-PDO é um produto de interesse na indústria biotecnológica, como precursor para diversos processos. Sua maior aplicação é na produção do bioplástico Politrimetileno Tereftalato (PTT), um termoplástico reciclável não biodegradável com qualidades superiores a do Polietileno Tereftalato (PET). Atualmente, o 1,3-PDO é produzido principalmente por síntese química, utilizando derivados do petróleo, mas a alternativa por microrganismos é vantajosa, pois gera menor emissão de poluentes, usa recursos renováveis e tem menor custo de produção. As bactérias apresentadas nesse trabalho são Escherichia coli recombinantes com genes da bactéria naturalmente produtora de 1,3-PDO Klebsiella pneumoniae. Analisando os dados da literatura, as Análises de Balanço de Fluxo (FBA) e dados experimentais, este projeto teve como objetivo eliminar total ou parcialmente os subprodutos lactato e acetato de E. coli recombinantes e analisar o impacto no metabolismo da bactéria e na produção de 1,3-PDO. Também foi o objetivo analisar o papel do gene yqhD na produção, combinando as mutações que produziam mais com as já obtidas, num esforço de melhorar o processo de produção estabelecido. Foram obtidas 4 linhagens da E. coli modificadas geneticamente, nas quais os seguintes genes foram alvos de estudo: ackA, ldhA, poxB, pta e yqhD. Também foram feitas combinações destas linhagens com uma cepa de E. coli já obtida com mutação na enzima Isocitrato Desidrogenase, na qual a especificidade por coenzimas foi alterada (NADP+ para NAD+), o que gerou mais 6 linhagens para estudo. Todos os genes propostos foram deletados e as linhagens tiveram a produção analisada. Com base em resultados preliminares foram construídas novas linhagens combinando as modificações, e todas tiveram a produção testada. A melhor das linhagens foi uma E. coli icdNAD+ΔyqhD, cultivada em biorreator. Foram observados aumentos no fator de conversão (até 0,489 molPDO/molglicerol) e produtividade (até 0,312gPDO.L-1.h-1). Mutantes derivadas desta, para produzir menos acetato, foram construídas e cultivadas em biorreator. Na tentativa de criar uma linhagem com potencial de ser usada na indústria, um gene essencial foi clonado no plasmídeo de produção, na tentativa de resolver problemas de larga escala. Esse novo plasmídeo, quando usado em uma linhagem específica, elimina a necessidade de usar antibiótico no meio e mantém o elevado número de cópias dos genes de interesse. Novos incrementos poderão ser obtidos explorando diferentes condições de oferta de oxigênio. Os objetivos iniciais foram alcançados: construir linhagens mais produtivas de 1,3-PDO e começar a estudar os efeitos da eliminação de genes responsáveis por alguns subprodutos na produção. Os resultados aqui obtidos ainda puderam indicar a importância de alguns genes, e agora perguntas mais específicas podem ser feitas, bem como hipóteses testadas.