Inibição da replicação do virus da raiva in vitro e in vivo por meio de interferência por RNA

• Autor(a) principal: Ono, Ekaterina Alexandrovna Durymanova
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/10/10134/tde-04012012-145741/
• topic: Antiviral; Antiviral; Rabies; Raiva; RNA interferência; RNA-intereference; siRNAs; siRNAs; Tratamento; Treatment

A raiva é uma zoonose que afeta todos os mamíferos e causa cerca de 55.000 mortes humanas por ano, causada pelo vírus da raiva. O vírus da raiva pertence à Ordem Mononegavirales, Família Rhabdoviridae e o Gênero Lissavirus. Atualmente, o tratamento humano se baseia no uso do Protocolo de Milwaukee composto de indução do paciente ao coma e uso de massiva terapia antiviral. O protocolo, apesar de ter sido utilizado duas vezes com sucesso, inclusive em um caso brasileiro, ainda requer aprimoramentos. Neste sentido, a interferência por RNA (RNAi) é uma nova abordagem para terapia de doenças virais. O objetivo deste trabalho foi avaliar a inibição da replicação do vírus da raiva in vitro e in vivo utilizando RNAi. Para tanto, foram utilizados três siRNAs (siRNA 124, siRNA 750, siRNA B) com a fita antisenso complementar ao mRNA da nucleoproteína (N) do vírus da raiva. Para o ensaio in vitro foram utilizadas a cepa PV do vírus da raiva e as células de BHK-21 (Baby hamster kidney). As monocamadas celulares foram infectadas com a cepa PV e depois de 2 horas de incubação transfectadas com cada um dos siRNAs em combinação com Lipofectamine 2000®. Depois de 22 horas as placas teste e controle foram submetidas à imunofluorescência direta (IFD) com conjugado globulina de coelho anti-nucleocapsídeo do vírus da raiva/isotiocianato de fluoresceína (BIO-RADTM). Os resultados revelaram títulos de 5,71logTCID50/ml, 5,56logTCID50/ml e 5,65logTCID50/ml para os siRNAs 124, B e 750, respectivamente, enquanto que, para a placa controle, o título foi 6,43logTCID50/ml. Para o ensaio in vivo, foram usados camundongos albino suíços de 21 dias com peso entre 11 e 14g, infectados com a cepa PV via intracerebral. Duas horas depois da infecção foi inoculada por via intracerebral uma solução do \"pool\" dos três siRNAs com Lipofectamine 2000® . Os animais com paralisia foram sacrificados e aqueles sobreviventes foram observados até completar 30 dias de observação quando foram, então, sacrificados. O sistema nervoso central de todos os animas foi recolhido e submetido a IFD. O título viral do grupo teste foi 7.03logLD50%/ml e do grupo controle 7.13logLD50%/ml. O resultado do ensaio in vitro demonstra que os siRNAs utilizados são efetivos em inibir a replicação do vírus da raiva, com eficiências equivalentes. A utilização do \"pool\" dos três siRNA em camundongos resultou em 30% de animais sobreviventes frente a 100 DL50% do vírus PV, enquanto que a mesma dose levou a 100% de mortalidade nos animais não tratados. Pode-se atribuir a menor eficiência em inibir a replicação do vírus da raiva in vivo quando se compara com os resultados in vitro possivelmente às elevadas doses virais utilizadas. Estes resultados, ainda que indiquem a necessidade de mais estudos, permitem concluir que a RNAi é uma tecnologia promissora como antiviral contra a raiva.