Desenvolvimento de uma multiplex-PCR baseada na amplificação dos três genes mitocondriais de Plasmodium para a detecção e diferenciação das espécies falciparum, vivax e malariae

• Autor(a) principal: Domingues, Wilson
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/99/99131/tde-20022019-093808/
• topic: Diagnosis; Diagnóstico; Doenças infecciosas; Genes; Genes; Infectious diseases.; Malaria; Malária; Plasmodium; Plasmodium; Polymerase chain reaction; Reação em cadeia da polimerase

A malária é a doença infecciosa mais prevalente em regiões tropicais e subtropicais e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com primers do 18S rRNA (4-8 cópias/parasito) no formato semi-nested ou nested-PCR são empregadas como referência. O genoma mitocondrial dos plasmódios é pequeno (6 kb) contendo três genes que codificam a enzima citocromo c oxidase I (cox I), a citocromo c oxidase III (cox III) e a citocromo b (cyt b), com número de cópias variando de 20-150/parasito. Esta pesquisa desenvolveu uma multiplex-PCR baseada na amplificação de cox I, cox III e cytb para a detecção simultânea de Plasmodium das espécies falciparum, vivax e malariae. A utilização de três pares de primers espécie-específicos, em uma única etapa de amplificação em lugar de uma nested-PCR (18S rRNA) poderia minimizar a ocorrência de contaminações (carry-over), reduzindo o custo das reações e o tempo para a liberação de resultados. A seleção dos primers empregou a estratégia ASO (Allele Specific Oligonucleotide), os amplificados das três espécies foram clonados e os plasmídeos contendo os insertos (controles positivos) foram usados em diluições seriadas determinar o limite de detecção que foi de 22,5 cópias para P. falciparum, 28,7 cópias para P. vivax e 32 cópias para P. malariae. Como cada parasito possui entre 20-150 cópias dos genes mitocondriais, a multiplex-PCR detectou 1 parasito das três espécies. Na etapa de validação, amostras antigas e recentes provenientes de regiões endêmicas foram testadas, todas com diagnóstico de gênero e espécie de Plasmodium. A multiplex-PCR foi mais sensível que a microscopia (gota espessa) quando 104 amostras foram testadas, e tão sensível quanto a semi-nested (n=60), a nested-PCR (n=6) e a PCR em Tempo Real (n=38). No entanto, na análise das espécies de Plasmodium, houve discordâncias da multiplex-PCR tanto em relação a gota espessa, quanto com a semi-nested-PCR principalmente na detecção de infecções mistas, havendo mais espécies detectadas pela semi-nested-PCR. Não houve discordâncias com a nested-PCR e a PCR em Tempo Real. Testes de especificidade da multiplex-PCR utilizando DNA de outros microrganismos e de doadores de banco de sangue não encontraram reações cruzadas (100% de especificidade). O estudo concluiu que a multiplex-PCR foi desenvolvida com sucesso, com especificidade de 100%, apresentando sensibilidade superior à gota espessa e equivalente à semi-nested-PCR, nested-PCR e PCR em Tempo Real, no entanto com discordâncias na identificação de espécies. Estudos prospectivos com amostras apresentando resultados discordantes nos testes moleculares de referência deverão ser testadas para avaliar se a nova ferramenta molecular possui sensibilidade superior.