Efeito de arcabouços 3D funcionalizados com aptâmeros antifibronectina na formação do coágulo e na osteogênese. Estudo ex vivo e in vivo

• Autor(a) principal: Costa, Natacha Malu Miranda da
• Data de Publicação: 2022
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/58/58132/tde-05122022-141445/
• topic: 3D scaffolds; Análise transcriptômica; Aptâmeros; Aptamers; Arcabouços 3D; Biomaterial; Biomaterial; Blood clot; Bone regeneration; Coágulo; Fibronectin; Fibronectina; Hidrogel; Hydrogel; Regeneração óssea; Transcriptomic analysis

Na odontologia, o uso de arcabouços tridimensionais tem sido empregado na regeneração óssea maxilo-facial. A adsorção de moléculas bioativas sobre a superfície de arcabouços (SCA) possivelmente otimize a osteogênese. Assim, nessa pesquisa avaliou ex vivo, in vitro (osteoblastos - OSB) e in vivo (defeito em calvária em 5 e 15 dias) o efeito da funcionalização de SCA (quitosana +20% de β-TCP) com aptâmeros (APT) anti-fibronectina (anti-FN) na osteogênese. A funcionalização dos SCA foi realizada com 20 µg de APT por simples adsorção. O coágulo fisiológico (PhC) foi desenvolvido por 16 horas sobre os SCA com ou sem aptamêros (APT) em defeitos críticos criados em calvária de ratos, caracterizando o estudo ex vivo. Em seguida, os OSB foram cultivados sobre o PhC formado nos SCA com e sem APT. Os ensaios in vitro foram realizados nos SCA sem PhC. A morfologia dos OSB e do PhC foi verificada por MEV. A caracterização celular do PhC foi realizada por citometria de fluxo (CF). A viabilidade celular, acúmulo de matriz mineralizada e expressão de ALP e BSP foram investigadas por MTT, ARS e IF, respectivamente. Adicionalmente, a expressão dos genes Alp, Runx2, Bsp, Ocn e Tgf-β1 foi verificada por RT-PCR. No experimento in vivo, foram realizadas as análises de Micro-CT, morfometria por coloração de tricrômio de Masom, IF, análise transcriptômica por RNAseq e RT-PCR em 5 e 15 dias nos grupos SCA e SCA+APT. Os resultados ex vivo mostraram elevada imunomarcação da ALP e IBSP no grupo com APT. A CF revelou maior detecção de CD90, CD45 e CD44 no PhC formado no mesmo grupo. Na MEV foi observada uma densa rede de fibrina enriquecida, composta com diferentes tipos celulares no PhC do SCA com APT. O RT-PCR mostrou mais expressão do gene Tgf-β1 no grupo SCA+APT+PhC+OSB. Em relação aos ensaios in vitro (sem o PhC) houve mais formação de matriz mineralizada em SCA+OSB+APT em 10 dias. O mesmo foi observado na IF evidenciando mais imunomarcação da IBSP em SCA+APT+OSB, enquanto a ALP foi mais prevalente no grupo com SCA+OSB. Nas análises in vivo, o Micro-CT revelou maior volume ósseo e menos porosidade óssea em 5 dias em SCA+APT. Além disso, houve mais formação de tecido colágeno, alguns pontos de formação óssea e elevada expressão da ALP no grupo APT em 5 dias, enquanto a expressão de RUNX2 foi mais predominante em SCA+APT 15 dias. Houveram mais genes diferencialmente expressos em 15 dias, segundo o RNAseq. A ontologia gênica (GO), mostrou diferenças nas funções biológicas associadas à adesão celular e aos canais iônicos da membrana celular. Em 15 dias, essa diferença foi associada à resposta imune, aos componentes da MEC, da atividade antioxidante e da polimerização do citoesqueleto celular (regulada negativamente). Esses achados foram validados verificando a expressão dos genes Vim, Hprt1, Clcn4, Cd24, Krtap7-1, Psme2, Tnf e Il-1β. Em conjunto, os resultados mostraram que o APT proporciona melhora no padrão de coagulação, na diferenciação osteoblástica e nos eventos iniciais associados à osteoimunologia.