Desenvolvimento, estudo e aplicações de nanobiocatalisadores proteolíticos magnéticos

• Autor(a) principal: Ungaro, Vítor Augusto
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46136/tde-04082021-235008/
• topic: Biocatálise; Biocatalysis; Endopeptidases; Endopeptidases; Enzyme immobilization; Imobilização de enzimas; Nanopartículas superparamagnéticas; Peptide synthesis; Proteólise; Proteolysis; Síntese de peptídeos; Superparamagnetic nanoparticles

As enzimas têm sido amplamente estudadas porque são essenciais para a ocorrência das transformações bioquímicas em seres vivos e exigidas em diversos setores da indústria. Em geral, os seus estudos de análise estrutural, modo de ação, inibição, mutação e modificação química (que inclui imobilização) tem o intuito de melhor entendê-las e, se possível, aprimorá-las ou evoluí-las. O presente trabalho visou desenvolver novos nanobiocatalisadores (NBCs) magnéticos proteolíticos, estudá-los e aplicá-los em proteólise e síntese de dipeptídeos. Assim, imobilizamos as endopeptidases termolisina bacteriana (TLN) e tripsina pancreática bovina (TRY) em nanopartículas de magnetita revestidas de sílica aminada (Fe3O4@sílica-NH2). Os Fe3O4@sílica-TLN e Fe3O4@sílicaTRY obtidos foram caracterizados em: atividade específica, recuperação dos meios reacionais, parâmetros cinéticos, estabilidade química, estabilidade térmica, pH ótimo e reuso, como fizemos com o Fe3O4@sílica-α-quimotripsina pancreática bovina (Fe3O4@sílica-α-QT) que desenvolvemos e estudamos anteriormente. Apesar de serem observadas quedas de atividade específica e dos valores dos parâmetros cinéticos pela imobilização por ligação covalente, todos os NBCs foram facilmente recuperáveis, suas estabilidades química e térmica foram aumentadas e eles puderam ser reutilizados por até 10 vezes. A aplicabilidade dos três novos NBCs em proteólises foi demonstrada usando as caseínas do leite bovino (X), uma fonte de peptídeos bioativos, e albumina do soro bovino (Y), uma proteína modelo. Em 24 h de incubação, foram detectados por LCMS fragmentos peptídicos de X e Y nos seguintes totais, respectivamente: 84 e 48 (Fe3O4@sílica-TLN); 34 e 28 (Fe3O4@sílica-TRY); 29 e 24 (Fe3O4@sílica-α-QT). Do total geral (247) de peptídeos, 64 indicaram potencial de bioatividade por semelhança de sequência de aminoácidos com as de peptídeos bioativos conhecidos. Por ser um processo de interesse industrial, a proteólise seguida de coagulação do leite catalisada pela Fe3O4@sílica-TLN também foi tentada e obtido sucesso, sendo o NBC reutilizado por 11 ciclos reacionais. Fe3O4@sílica-TLN e Fe3O4@sílica-α-QT ainda foram examinadas na aplicabilidade em síntese biocatalisada de dipeptídeos, opção enantioseletiva e mais limpa à síntese química. Usando rota sintética estabelecida por nós, foram estudadas as sínteses de: Ala-Phe (apresenta sabor amargo), Asp-Phe-OMe (apresenta sabor doce), Phe-Phe e Fmoc-Phe-Phe (apresentam propriedades gelificantes). A formação da ligação peptídica catalisada pela TLN livre ocorreu com rendimentos reacionais superiores (73- 85 %) aos obtidos com a Fe3O4@sílica-TLN nos casos das sínteses de Z-Ala-Phe-OMe, Z-Asp-Phe-OMe e Z-Phe-Phe-OMe (26-52 %), mas comparável no caso da síntese de Fmoc-Phe-Phe-OMe (72 %). A hidrólise do éster dos Z-Ala-Phe-OMe, Z-Phe-Phe-OMe e Fmoc-Phe-Phe-OMe catalisada por Fe3O4@sílica-α-QT ocorreu com altos rendimentos (72-91%). De forma inédita, a remoção do grupo protetor benziloxicarbonil (Z) por hidrogenação catalisada pelo nanocatalisador magnético Fe3O4@sílica-Pd forneceu os Ala-Phe, Asp-Phe-OMe e Phe-Phe desejados com 74, 81 e 70 %. Os NBCs e o Fe3O4@sílica-Pd se mostraram facilmente recuperáveis dos meios reacionais e reutilizáveis por 1-10 vezes. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que os objetivos traçados foram atingidos, pois novos NBCs proteolíticos magnéticos e uma rota sintética verde foram desenvolvidos, obtidos e aplicados em proteólises e sínteses de peptídeos. Esses são processos biotecnológicos importantes no sequenciamento proteico, na indústria alimentícia e na geração/produção de peptídeos bioativos.