Estudos biofísicos da interação entre a Na,K-ATPase e a subunidade gama, ATP, Na+, K+, DPPC, DPPE e colesterol

• Autor(a) principal: Yoneda, Juliana Sakamoto
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-16072020-135259/
• topic: Agregação proteica; Calorimetria; Calorimetry; Estabilidade térmica; Na K-ATPase; Na,K-ATPase; Oligomerização; Oligometrization; Protein aggregation; Thermostability

A Na,K-ATPase (NKA) é expressa em todas as células animais e é um dos membros mais importantes da família das ATPases do tipo P. Consiste de três subunidades: α, β e γ. Essa proteína é responsável por gerar o gradiente eletroquímico de Na+ e K+ através da membrana plasmática pelo uso da energia derivada da hidrólise de ATP. Neste trabalho estudos da termoestabilidade da Na,K-ATPase foram feitos. Os resultados mostraram que a fração de membrana rica em NKA alcançou a máxima estabilidade térmica entre as amostras analisadas. Após a solubilização da proteína com C12E8, a estabilidade da NKA diminuiu pela metade, no entanto, essa amostra solubilizada possuía atividade enzimática. Pela análise dos valores de variação de entalpia total (ΔHt) foi possível observar que a adição do extrato contendo a subunidade γ à enzima solubilizada (α/β) levou à formação do complexo (αβγ) com maior estabilidade térmica. Um aumento em ΔHt também foi verificado quando a NKA solubilizada foi reconstituída em sistemas de lipossomos. A conformação E2, induzida pelos íons K+, foi duas vezes mais estável que a conformação E1, que é induzida pelos íons Na+. A interação da conformação E2 com o substrato ATP não modificou o valor de variação de entalpia, mas com a liberação dos íons K+ ocorreu uma mudança conformacional, que foi suficiente para resultar em um termograma com um perfil diferente. Além do estudo de estabilidade térmica, a calorimetria também foi utilizada com o propósito de estudos cinéticos da NKA. Os parâmetros (Km e Vmáx) foram determinados e os valores de Km obtidos estavam dentro da faixa submilimolar esperada. A utilização de duas concentrações diferentes de proteína resultou em curvas de titulação calorimétrica distintas o que nos levou a especular que a mudança no perfil poderia ser explicada pelo estado oligomérico que a NKA assumiu em solução dependendo da sua concentração. Os resultados obtidos pelas técnicas de Espalhamento Dinâmico de Luz e Ultracentrifugação Analítica mostraram que a amostra de NKA se divide em diferentes populações oligoméricas em solução. As principais populações são de monômero - (αβ) e tetrâmero - (αβ)4. Há também a formação de um agregado inespecífico que pode ser retirado por filtração simples, mas que com o tempo volta a se formar em solução. E finalmente, os experimentos de ITC mostraram que provavelmente ocorre uma interação direta do colesterol com a NKA.