Estudos da interação entre a mortalina humana e as duas isoformas das co-chaperonas GrpEs

• Autor(a) principal: Yoshida, Leonardo
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-09082019-085641/
• topic: GrpE; GrpE; mortalin; mortalina; mtHsp70; mtHsp70; pulldown; pulldown

As Hsp70 são proteínas centrais no sistema de homeostasia proteica da célula. Pelo fato delas estarem envolvidas em uma grande variedade de processos relacionados ao enovelamento correto das proteínas, elas estão envolvidas em processos como envelhecimento, doenças degenerativas, como Alzheimer, e alguns tipos de câncer. Uma das etapas essenciais no seu ciclo funcional é a troca de ADP por ATP, um processo que é acelerado pelos fatores de troca de nucleotídeos (NEFs) que, em bactérias e mitocôndrias, correspondem à proteína GrpE. Por razões ainda não bem compreendidas, duas isoformas estão presentes nas mitocôndrias de humanos, a GRPEL1 e a GRPEL2. Pouco se sabe da dinâmica da interação destas com a Hsp70 mitocondrial de humanos (mortalina) porque havia uma dificuldade em se obter esta proteína na sua forma solúvel e funcional (atualmente superada). Dessa forma, o presente trabalho de pesquisa busca caracterizar os aspectos bioquímicos e biofísicos dessas proteínas junto à mortalina, visando compreender a dinâmica da interação entre elas, contribuir para a elucidação da rede de interações das Hsp70 e compreender o porquê de 2 isoformas estarem presentes em mamíferos. Para isto, ensaios in vitro das proteínas mortalina, GRPEL1 e GRPEL2 recombinantes foram realizados. Elas foram expressas e purificadas por cromatografia de afinidade ao Ni2+ e gel filtração. As GrpEs tiveram seus graus de pureza e enovelamento correto avaliadas por SDS-PAGE e dicroísmo circular. Suas estruturas terciárias e quaternárias foram avaliadas através da cromatografia de exclusão molecular analítica e do crosslinking químico. Com as proteínas tendo sido purificadas, ensaios de interação molecular foram realizados através do pulldown, do ITC e, adicionalmente, foram feitos ensaios de agregação para investigar um possível papel das GrpEs no processo de agregação térmica da mortalina. Todas as proteínas puderam ser obtidas solúveis e com alto grau de pureza. Os ensaios de pulldown validaram a interação entre a mortalina e as GrpEs, mas essas interações não foram detectadas no ITC. Por fim, não houveram evidências de que as GrpEs atuem no sentido de prevenir a agregação térmica da mortalina.