Prospecção de enzimas no fungo Purpureocillium lilacinum utilizando as técnicas de proteoma: produção recombinante de enzimas com potencial biotecnológico e avaliação de antifúngicos

• Autor(a) principal: Pedezzi, Rafael
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-19122019-084515/
• topic: Antifungal resistance; Expressão recombinante; Fungal peptidases; Peptidases fúngicas; Purpureocillium lilacinum; Purpureocillium lilacinum; Recombinant expression; Resistência a antifúngicos; Transcriptoma; Transcriptome

O fungo ascomiceto Purpureocillium lilacinum pode ser encontrado em solo, vegetação em decomposição, insetos, nematoides e outros locais. Apresenta grande importância agrícola, visto que pode ser utilizado como controle biológico por ser capaz de infectar e matar nematoides pragas de culturas, graças às suas enzimas, como peptidases e quitinases. Além disso, o fungo apresenta importância médica, pois é capaz de gerar infecção em humanos. A terapêutica das doenças infecciosas causadas por P. lilacinum é dificultada pelo fato de ele apresentar resistência a antifúngicos \"azólicos\", principais moléculas aplicadas na clínica médica atualmente. O presente trabalho teve como objetivo explorar molecularmente o fungo P. lilacinum com relação à sua capacidade de resistir a antifúngicos e à sua capacidade de produzir peptidases robustas, com potencial de aplicação biotecnológica. Ferramentas moleculares como transcriptômica e proteômica foram aplicadas para acessar os dados moleculares do fungo e viabilizar análises de expressão diferencial para verificar as respostas aos antifúngicos fluconazol e itraconazol e anotação gênica para prospecção de peptidases. Foi observado que P. lilacinum promove um aumento de expressão dos genes alvo dos antifúngicos e dos genes que codificam bombas de efluxo. Com esse mecanismo, não há acúmulo de antifúngico intracelular e há compensação numérica da enzima que está sendo inibida pelo antifúngico com mais expressão da mesma. Dessa forma, o fungo consegue manter a síntese de ergosterol normalizada. As enzimas prospectadas e expressas de maneira recombinante em Pichia pastoris foram uma serino peptidase (rPl_SerPep) e uma metalo peptidase (rPl_MetPep). A rPl_SerPep se mostrou alcalina, com temperatura ótima aparente de 60 °C e termoestável. Já a rPl_MetPep se mostrou ativa em pH neutro e com temperatura ótima aparente de 40 °C. Essas enzimas se mostraram promissoras para futuros testes de aplicação biotecnológica.