Análise da expressão de genes regulados pela proteína Dermicidina nas células do melanoma maligno G-361 pelo método de DNA-microarray

• Autor(a) principal: perez Sosa, Nancy Marcela
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5155/tde-24102014-124556/
• topic: Dermcidin; Dermicidina; Espectrometria de massas; Expressão gênica; Gene expression; Histonas; Histones; Mass spectrometry; Melanoma; Melanoma; NF-kB; NF-kB

A proteína dermicidina (DCD) é codificada por um gene localizado na porção 12q13 do cromossomo 12, presente apenas em primatas e humanos. A proteína é secretada por células de glândulas da pele, melanócitos, neurônios e células epiteliais da mama normal. Alguns estudos inciais revelaram a participação da proteína DCD em processos oncogênicos nos carcinomas de mama, próstata e melanoma pela sua capacidade de atuar como um fator de crescimento e sobrevivência celular. Nos estudos realizados no nosso laboratório mostramos que a DCD é expressa em células normais da pele, placenta, cérebro e em vários tumores, incluindo os carcinomas de mama e melanoma maligno. Ensaios biológicos e bioquímicos mostraram que o \"knockdown\" da expressão de DCD no melanoma maligno G-361 via RNA de interferência (RNAi) diminuiu significativamente o crescimento in vitro em cultura celular e a formação de tumores em camundongos Nude. Resultados similares foram obtidos quando camundongos Nude transplantados com células de melanoma G-361 foram tratados com anticorpos policlonais de coelhos contra a proteína DCD. Para compreender melhor o papel da proteína DCD na transformação de células de melanoma G-361 foram feitos ensaios de microarranjo de DNA para identificar os genes diferencialmente expressos entre as sublinhagens pLKO (controle) e IBC-I que expressa o shRNA para o mRNA da DCD. Entre os 374 genes alterados pelo silenciamento, encontramos 162 com expressão aumentada e 212 com a expressão reduzida. Os estudos de bioinformática pelo software MetaCore mostraram que o silenciamento do gene DNA modula as vias canônicas e redes de sinalização mediadas pelo receptores e ligantes da família BAFF/APRIL que contralam a ativação do fator de transcrição NF-kB, bem como para histonas envolvidas na remodelação da cromatina. Os níveis de expressão de mRNA de 9 genes de interesse foram validados por ensaios de RT-qPCR. Em uma segunda fase do estudo, foram analisadas as proteínas presentes em extratos nuclares dos clones pLKO e IBC-I de melanoma maligno G-361 por espectrometria de massas. Nos extratos proteicos da sublinhagem pLKO foram identificadas 74 proteínas nucleares, enquanto que na sublinhagem IBC-I foram identificadas 31 proteínas. Um grupo de 21 proteínas foi identificado em ambas sublinhagens. Estudos de bioinformática pelo programa STRING revelou que 14 das proteínas identificadas na sublinagem G-361-pLKO faziam interações diretas ou indiretas com a DCD. A rede formada por estas proteínas tem como centro a proteína p53, uma proteína chave na regulação do programa de morte celular e sobrevivência ao estresse oxidativo. Por outro lado, notou-se que a maioria das proteínas identificadas no extrato nuclear da sublinhagem IBC-I é da família das histonas e que poderiam atuar em complexos de remodelação da cromatina nas células G-361-IBC-I. Nossos resultados nos possibilitaram sugerir que futuros estudos sobre a expressão das histonas e suas modificações pós-traducionais poderão ajudar a desvendar o possível papel da DCD na regulação epigenética do melanoma e em outros tipos de cânceres