Diagnóstico de Hantavírus por detecção genômica com estudo filogenético e produção de uma proteína N recombinante

• Autor(a) principal: Moreli, Marcos Lazaro
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17138/tde-04092020-140921/
• topic: ELISA; ELISA; Estudos filogenéticos; Expressão da proteína N; Hantavirus; Hantavírus; IgG; IgG; Phylogenetic studies; Protein N expression; RT-PCR; RT-PCR; Sequencing N Gl G2; Seqüenciamento de N Gl G2

Hantaviroses são zoonoses distribuídas mundialmente, associadas a roedores (família Muridae) e transmitidas ao homem pela inalação de partículas virais contidas nas excretas destes roedores. Os Hantavírus são causadores de duas doenças principais: a Febre Hemorrágica com Síndrome Renal, de baixa letalidade, que ocorre na Ásia e Europa e a Síndrome Pulmonar e Cardiovascular por Hantavírus (SPCVH) que ocorre nas Américas, associada a roedores da subfamília Sigmodontinae. Hantavirus são um gênero na família Bunyaviridae. São envelopados, com 80 a l10 nm, possuindo RNA de fita simples e polaridade negativa, divididos em 3 segmentos, o grande (L), o médio (M) e o pequeno (S), que codificam respectivamente a polimerase viral, as glicoproteínas de superfíce (G1 e G2) e a proteína do nucleocapsídeo (N). Vários Hantavírus tem sido identificados em países da América do sul, incluindo o Brasil, onde são conhecidas as espécies, Juquitiba (JUQ), Araraquara (ARA), Castelos dos Sonhos (CAS), Anajatuba (ANJ) ou Rio Mearim (RIME). A SPCVH é problema de saúde pública na região de Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, onde já se notificou 37 casos desde 1998, com alta letalidade. O diagnóstico de infecções por Hantavírus no país tem sido feito por ELISA, detectando anticorpos contra a proteína N dos vírus Sin Nombre e Andes. Um método alternativo ao ELISA é a RT-PCR. Como parte deste trabalho, selecionou-se primers de alta homologia entre distintos Hantavírus, para utilização em RT-PCR. Por esta técnica, o gene N de Hantavírus foi detectado em 8 de 9 amostras séricas de pacientes com SPCVH (88,9%) e em todas as 9 amostras por uma nested-PCR (100%). Seqüenciou-se nucleotídios dos amplicons da RT-PCR e da nested-PCR evidenciando alta similaridade destas seqüências com o gene N do Hantavírus ARA (94,8% a 99,1 %). A RT-PCR e a nested-PCR mostraram-se métodos úteis ao diagnóstico de infecções por Hantavirus, prestando-se seus ... produtos a estudos filogenéticos. Também, selecionou-se primers para amplificação por RT-PCR dos genes G1 e G2. De 10 pacientes que tiveram amplicons de G1, G2 e N seqüenciados, fez-se análise filogenética. Para tanto, seqüências foram primeiramente alinhadas pelo programa ClustalW e editadas com o BioEdit e os cladogramas feitos com POY 3.1.1, por otimização direta, utilizando algoritmo de máxima-parsimônia e análise simultânea de N, Gl e G2. A edição de árvores foi feita no programa WinClada e mostrou 3 grupos distintos de vírus da América do Sul. O do vírus Andes (AND), o de outros vírus Argentinos, Pergamino (PRG) , Maciel (MAC), Lechiguanas, Hu39694 e o do vírus Araraquara (ARA), que se agrupou com as seqüências de fragmentos genômicos obtidos dos pacientes. A proximidade filogenética mostra que o Hantavirus causador de SPCVH na região de Ribeirão Preto foi o ARA. Também, seqüenciou-se todo o segmento S do ARA, e com este buscou-se expressar o gene da proteína N. Para tanto, selecionou-se vários primers e com eles, produziu-se amplicons de \'DA ORDEM DE\' 500, \'DA ORDEM DE\' 1400, \'DA ORDEM DE\' 1500 e \'DA ORDEM DE\' 1700 pb, que foram clonados e seqüenciados. O segmento S inteiro de ARA possui 1858 nucleotídios (nt) e a sua região codificadora de N, 1287 nt. Comparou-se filogeneticamente o gene de N com o de outros Hantavírus, tendo este se mostrado-se mais similar com MAC e PERG. Expressou-se o gene de N com novos primers e um amplicon com tamanho esperado foi diretamente clonado no vetor de expressão pET 200D, que transformou colônia de Escherichia coli BL21. Esta bactéria, induzida com IPTG produziu altos teores de uma proteína detectável em WesternBlot por anticorpos de soros de pacientes convalescentes de SPCVH. Avaliou-se o grau de solubilidade e purificou-se esta proteína N por coluna de afinidade Ni-NTA, quantificou-se o produto e utilizou-se o mesmo em ELISA juntamente com controle ... negativo (Escherishia coli, contendo plasmídeo sem gene de N). O ELISA foi testado em 24 amostras de soro utilizando a proteína N recombinante de ARA como antígeno, sendo que 17 destas foi detectado anticorpos IgG contra Hantavírus e pode ser utilizado rotineiramente no diagnóstico da SPCVH.