Biorreatores capilares de NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi: desenvolvimento e aplicação na triagem de inibidores seletivos

• Autor(a) principal: Calil, Felipe Antunes
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-21072014-144130/
• topic: Ensaios enzimáticos; Enzymatic assays.; Expressão heteróloga; Heterologous expression; Immobilization of enzymes; Imobilização de enzimas; NTPDase-1 T.cruzi; NTPDase-1 T.cruzi

Uma das estratégias utilizadas no desenvolvimento de novas drogas envolve a descoberta de compostos que modulem a atividade de enzimas, importantes no processo infeccioso de patógenos. Uma abordagem interessante na triagem de novos ligantes é o uso de métodos baseados na imobilização de enzimas em suportes cromatográficos acoplados a sistemas de cromatografia líquida. O uso de IMERs (Immobilized Enzyme Reactors) como uma fase estacionária acoplado a sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência consiste em uma estratégia para triagem de compostos rápida e eficiente e tem vantagens em relação ao uso de enzimas em solução. A enzima NTPDase-1 de Trypanosoma cruzi age como um facilitador da infecção do patógeno, inibindo assim a resposta imune do hospedeiro, permitindo uma infecção silenciosa, o que sugere seu uso como um bom alvo na busca por inibidores. Neste trabalho, a enzima NTPDase-1 foi imobilizada na parede interna de capilares de sílica fundida formando ICERs (Immobilized Capillary Enzyme Reactors). Estudos das condições de uso destes biorreatores juntamente com o desenvolvimento de um método cromatográfico multidimensional, foram realizados e validados. A otimização do método cromatográfico e sua validação, apresentaram ótimos resultados em relação aos valores obtidos para os parâmetros avaliados para métodos bioanalíticos. A imobilização da enzima foi realizada com sucesso, sendo possível a detecção da atividade catalítica no sistema cromatográfico (TcNTPDase1-ICER). Foi realizado também, o estudo cinético para ATP no TcNTPDase1-ICER, obtendo-se KM de 0,317 ± 0,044 mM, que comparado com estudos em solução, KM de 0,096 mM, ainda apresenta grande afinidade pelo substrato.