Desenvolvimento e validação de técnica imuno-histoquímica utilizando anticorpo monoclonal para o diagnóstico da leishmaniose cutânea
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/51527 |
Resumo: | A leishmaniose tegumentar (LT) continua sendo problema global de saúde pública, que se manifesta principalmente através de lesões cutâneas (leishmaniose cutânea - LC). Na América Latina, o Brasil é o país com maior registro de casos, com várias espécies de Leishmania associadas aos casos humanos. O diagnóstico laboratorial é essencial e um dos grandes desafios para o controle da doença. Desta forma, desenvolvemos e validamos uma técnica de imuno-histoquímica (IHQ) utilizando anticorpo monoclonal (AcMo), para o diagnóstico da LC. Inicialmente, foi realizada uma revisão sistemática a fim de identificar potenciais alvos avaliados para o diagnóstico imunológico da LT. Antígenos com características distintas foram selecionados e considerados promissores para produção do AcMo e aplicação na técnica de IHQ. Os seis antígenos selecionados foram: triparedoxina mitocondrial peroxidase (mTXNPx); homológo do receptor para proteína quinase C ativada (LACK); fosfatase ácida secretada (sAcP); proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11); proteína hipotética (LbPH) e proteína quinase ativada por mitógeno 4 (MAPK4). As sequências de nucleotídeos dos antígenos selecionados foram sintetizadas e inseridas no plasmídeo pET28a. Vetores de clonagem e de expressão foram transformados com os plasmídeos, para produção dos antígenos recombinantes. Os antígenos produzidos foram utilizados como imunógenos em camundongos BALB/c, para produção dos AcMos por meio da técnica de hibridização somática. A imunorreatividade dos AcMos foi avaliada através da técnica de Western blotting, utilizando os respectivos antígenos recombinantes e antígenos solúveis de L. amazonensis, L. braziliensis e L. guyanensis. Em seguida, a técnica de IHQ foi realizada em biópsias de pele de hamsters experimentalmente infectados com estas espécies de Leishmania. A padronização da técnica de IHQ foi realizada utilizando o AcMo anti-mTXNPx e dois sistemas de detecção constituídos por polímero conjugados com as enzimas peroxidase (IHQ-POD) e fosfatase alcalina (IHQ-FA). A validação destes protocolos de IHQ foi relizada em biópsias de pele de 49 pacientes com LC diagnosticados por meio da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR), que apresentavam resultados de exame direto e cultura, realizados como diagnóstico de rotina. Foram também incluídos 37 pacientes que apresentando outras doenças dermatológicas infecciosas. O exame histopatológico (HE) e a IHQ foram realizados em todos os pacientes incluídos neste estudo. Na revisão sistemática, foram encontrados potenciais alvos antigênicos para uso em técnicas imunológicas para o diagnóstico de LT, LC e leishmaniose mucosa (LM). No entanto, a maioria dos estudos são provas de conceito, fato que reforça a necessidade de desenvolvimento de estudos de validação mais abrangentes. Através da técnica de Western blotting e IHQ em lesão de animal experimentalmente infectado, foi comprovada a imunorreatividade dos AcMos anti-mTXNPx e anti-LACK. No estudo de validação empregando AcMos anti-mTXNPx, a maior sensibilidade foi observada para IHQ-FA (85,7%), seguida por IHQ-POD (79,6%), exame direto (77,6%), HE (65,3%) e cultura in vitro (49%). IHQ e HE apresentaram especificidade acima de 90%. A positividade do exame direto e da cultura aumentou significativamente quando os resultados foram combinados com da IHQ-FA, atingindo 95,9% e 93,9%, respectivamente. Através da análise de regressão logística verificamos que as técnicas de IHQ e HE são capazes de detectar pacientes com LC independentemente da carga parasitária. Os resultados obtidos neste estudo demonstram o potencial da técnica de IHQ para o diagnóstico da LC no Brasil e possibilita o desenvolvimento de novas alternativas diagnósticas para o controle dessa doença negligenciada. |
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Freire, Mariana LourençoXavier, Marcelo Antônio PascoalOliveira, Edward José deXavier, Marcelo Antônio PascoalCarvalho, Andréa Teixeira deAlves, Erica Alessandra RochaLaurenti, Márcia DalastraLima, Wanderson Geraldo deOliveira, Edward José de2022-03-03T18:28:03Z2022-03-03T18:28:03Z2021FREIRE, Mariana Lourenço. Desenvolvimento e validação de técnica imuno-histoquímica utilizando anticorpo monoclonal para o diagnóstico da leishmaniose cutânea. 2021. 166 f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Instituto René Rachou, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2021.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/51527A leishmaniose tegumentar (LT) continua sendo problema global de saúde pública, que se manifesta principalmente através de lesões cutâneas (leishmaniose cutânea - LC). Na América Latina, o Brasil é o país com maior registro de casos, com várias espécies de Leishmania associadas aos casos humanos. O diagnóstico laboratorial é essencial e um dos grandes desafios para o controle da doença. Desta forma, desenvolvemos e validamos uma técnica de imuno-histoquímica (IHQ) utilizando anticorpo monoclonal (AcMo), para o diagnóstico da LC. Inicialmente, foi realizada uma revisão sistemática a fim de identificar potenciais alvos avaliados para o diagnóstico imunológico da LT. Antígenos com características distintas foram selecionados e considerados promissores para produção do AcMo e aplicação na técnica de IHQ. Os seis antígenos selecionados foram: triparedoxina mitocondrial peroxidase (mTXNPx); homológo do receptor para proteína quinase C ativada (LACK); fosfatase ácida secretada (sAcP); proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11); proteína hipotética (LbPH) e proteína quinase ativada por mitógeno 4 (MAPK4). As sequências de nucleotídeos dos antígenos selecionados foram sintetizadas e inseridas no plasmídeo pET28a. Vetores de clonagem e de expressão foram transformados com os plasmídeos, para produção dos antígenos recombinantes. Os antígenos produzidos foram utilizados como imunógenos em camundongos BALB/c, para produção dos AcMos por meio da técnica de hibridização somática. A imunorreatividade dos AcMos foi avaliada através da técnica de Western blotting, utilizando os respectivos antígenos recombinantes e antígenos solúveis de L. amazonensis, L. braziliensis e L. guyanensis. Em seguida, a técnica de IHQ foi realizada em biópsias de pele de hamsters experimentalmente infectados com estas espécies de Leishmania. A padronização da técnica de IHQ foi realizada utilizando o AcMo anti-mTXNPx e dois sistemas de detecção constituídos por polímero conjugados com as enzimas peroxidase (IHQ-POD) e fosfatase alcalina (IHQ-FA). A validação destes protocolos de IHQ foi relizada em biópsias de pele de 49 pacientes com LC diagnosticados por meio da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR), que apresentavam resultados de exame direto e cultura, realizados como diagnóstico de rotina. Foram também incluídos 37 pacientes que apresentando outras doenças dermatológicas infecciosas. O exame histopatológico (HE) e a IHQ foram realizados em todos os pacientes incluídos neste estudo. Na revisão sistemática, foram encontrados potenciais alvos antigênicos para uso em técnicas imunológicas para o diagnóstico de LT, LC e leishmaniose mucosa (LM). No entanto, a maioria dos estudos são provas de conceito, fato que reforça a necessidade de desenvolvimento de estudos de validação mais abrangentes. Através da técnica de Western blotting e IHQ em lesão de animal experimentalmente infectado, foi comprovada a imunorreatividade dos AcMos anti-mTXNPx e anti-LACK. No estudo de validação empregando AcMos anti-mTXNPx, a maior sensibilidade foi observada para IHQ-FA (85,7%), seguida por IHQ-POD (79,6%), exame direto (77,6%), HE (65,3%) e cultura in vitro (49%). IHQ e HE apresentaram especificidade acima de 90%. A positividade do exame direto e da cultura aumentou significativamente quando os resultados foram combinados com da IHQ-FA, atingindo 95,9% e 93,9%, respectivamente. Através da análise de regressão logística verificamos que as técnicas de IHQ e HE são capazes de detectar pacientes com LC independentemente da carga parasitária. Os resultados obtidos neste estudo demonstram o potencial da técnica de IHQ para o diagnóstico da LC no Brasil e possibilita o desenvolvimento de novas alternativas diagnósticas para o controle dessa doença negligenciada.Tegumentary leishmaniasis (TL) is still a worldwide public health problem, presenting mainly through skin lesions (cutaneous leishmaniasis – CL). In Latin America, most cases occur in Brazil, and several Leishmania species have been associated with human cases. The laboratory diagnosis is crucial and considered one of the pillars to disease control. In this manner, the development and validation of an immunohistochemistry assay (IHC) using monoclonal antibody (mAb) for CL-diagnosis were performed. Firstly, a systematic review identifing potential antigenic targets that have been previously evaluated for TL-immunodiagnosis was performed. Antigens were further selected according specific characteristics and considered potential for CL-diagnosis through IHC. The six selected antigens were: mitochondrial tryparedoxin peroxidase (mTXNPx); Leishmania homologue of activated C kinase (LACK); secreted acid phosphatase (sAcP); kinetoplastid membrane protein-11 (KMP-11); hypothetical protein (LbHP) and Mitogen-activated protein kinase 4 (MAPK4). The amino acid sequences were selected, further synthetized, and inserted in pET28a plasmid by GenScript. Those plasmids were inserted into cloning and expression vectors for the production of recombinant antigens (rAg). The rAgs were used as immunogens in BALB/c mice for mAb production through somatic hybridization. The immunoreactivity of each mAb was tested by Western blotting using soluble antigens of L. amazonensis, L. braziliensis and L. guyanensis. Subsequently, the IHC was performed on skin biopsies from hamsters infected with the same Leishmania species. The standardization and validation of IHC was performed with anti- mTXNPx mAb through two detection systems consisting of polymer with peroxidase enzyme (IHC-HRP) and alkaline phosphatase (IHC-AP). The IHC was validated on skin biopsy from 49 CL-patients diagnosed by clinical examination and real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). For this group, the direct examination and in vitro culture were also performed. Furthermore, 37 patients presenting other dermatological infectious diseases were included. The histopathology (HE) and IHC were performed for all patients included in the study. A total of 81 antigens were found in the systematic review for the diagnosis of TL, CL and mucosal leishmaniasis (ML). However, a large number of proof-of-concept studies reinforce the need for further studies. In the IHC validation study, the higher sensitivity value was observed for IHC-AP (85.7%), followed by IHC-HRP (79.6%), direct examination (77.6%), HE (65,3%) and in vitro culture (49%). Both IHCs and histopathology presented specificity over 90%. The IHC-AP combined with direct examination enhanced the positivity to 95.9%, and the same IHC combined with HE increased the positivity to 93.9%. The multivariate regression analysis showed that IHC and HE were the only tests able to detect CL-patients regardless the parasite burden. The IHC evaluated here is useful to detect the main Leishmania species causing CL in Brazil and could support the diagnostic strategies for disease control.CAPESFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.porLeishmaniose CutâneaDiagnósticoImuno-HistoquímicaAnticorpos MonoclonaisLeishmaniasisCutaneousDiagnosisImmunohistochemistryAntibodies MonoclonalLeishmaniose CutâneaDiagnósticoImuno-HistoquímicaDesenvolvimento e validação de técnica imuno-histoquímica utilizando anticorpo monoclonal para o diagnóstico da leishmaniose cutâneainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis2021Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz.. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade de São Paulo. São Paulo, SP, BrasilUniversidade Federal de Ouro Preto. Ouro Preto, MG, BrasilBelo Horizonte, MGPrograma de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-83082https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/51527/1/license.txt9193a7c197bc67acd023525e72a03240MD51ORIGINALT_2021_Mariana Lourenço Freire.pdfT_2021_Mariana Lourenço Freire.pdfapplication/pdf18892758https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/51527/2/T_2021_Mariana%20Louren%c3%a7o%20Freire.pdf5941c56f11f19a53b20433e8438162edMD52icict/515272022-03-23 13:51:36.761oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352022-03-23T16:51:36Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - 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FREIRE, Mariana Lourenço. Desenvolvimento e validação de técnica imuno-histoquímica utilizando anticorpo monoclonal para o diagnóstico da leishmaniose cutânea. 2021. 166 f. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Instituto René Rachou, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2021. |
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